Nature | 衰老个体中甲基丙二酸的积累可促进肿瘤进展
科学研究发现人类在65岁后患癌症和相关死亡的风险显著增加，但对于年龄和癌症之间复杂联系的研究却仍处于起步阶段。过去几十年人们将老年人易感癌症的原因归咎于其环境暴露的时间长于年轻人，却忽略了饮食、运动和小分子代谢物在新陈代谢衰老过程中所起的作用。美国威尔康奈尔医学癌症中心John Blenis研究团队采用年轻和老年健康供体10%的人血清（HS）分别培养人A549和HCC1806癌细胞，对其进行代谢组学、转录组学和分子生物学验证等分析，发现随着年龄的增长而发生的代谢改变可产生有利于肿瘤的系统微环境，与衰老有关的代谢产物甲基丙二酸（MMA）促进了肿瘤生长和侵袭，相关成果发表于《Nature》。
作者首先提出假设“衰老可能产生一个促进肿瘤进展和侵袭性的系统微环境”。接下来分别从30名年轻（年龄≤30岁）和30名高龄（年龄≥60岁）的健康供体中获取10%的人血清（HS） 用于培养人类癌症A549和HCC1806细胞。发现用老年血清培养的细胞上皮标志物钙黏蛋白明显缺失，间充质标志物纤维连接蛋白和波形蛋白明显增加，且与侵袭表型相关的serpine1和MMP2蛋白表达增加（图1b）。此外，老年血清促进了两种不同且广泛使用的化疗药物卡铂和紫杉醇的耐药性（图1c）。
基于饮食、运动和热量限制等代谢干预措施在减轻癌症易感性和结果方面的有效性，研究者针对代谢的变化，首先借助靶向代谢组学检测了供者血清的代谢成分，在定量到的179种循环代谢产物中，发现只有10种代谢物发生显著改变，即谷胱甘肽、亚精胺、谷氨酰胺和α-酮戊二酸在老年血清中显著下降；而磷酸烯醇式丙酮酸、喹啉酸和甲基丙二酸（MMA） 三种代谢物在老年供体的血清中持续增加。
接下来作者分别用磷酸烯醇式丙酮酸、喹啉酸和甲基丙二酸（MMA）处理A549细胞以探讨其对癌细胞的诱导侵袭作用，发现只有MMA诱导了完全的前侵袭性EMT（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT，上皮细胞向间充质细胞转化）样表型，钙黏蛋白下降的同时纤维连接蛋白和波形蛋白升高。
图1. 衰老引发的肿瘤侵袭的循环因子
由于大规模非靶向代谢组学因其缺乏敏感性且不能够准确定量而未被广泛认可，于是作者再次借助靶向定量代谢组学验证性检测了60例供者血清中MMA的绝对浓度，发现老年供者血清中MMA水平（15 -80μM）高于年轻供者（0.1 -1.5μM）（图2a）。
接下来作者用MMA处理HCC1806、A549和MCF-10A细胞（EMT研究常见模型）以研究MMA的前侵袭性，发现1 mM及以上的浓度足以诱导EMT样表型和前侵袭蛋白的表达（图2b）。MMA的前侵袭作用具有特异性，MMA对卡铂和紫杉醇具有耐药性，增加了细胞的迁移和侵袭能力（图2c），并促进了CD44的升高和CD24的下降。用MMA体外处理MDA-MB-231细胞会增强侵略性标记，并以浓度依赖的方式牢固地增加细胞在无胸腺小鼠肺部的定植能力。综上数据表明MMA具有促进前侵袭性特征，并有助于促进肿瘤进展所需的细胞可塑性。
为了评估血清的另一种成分能否促进MMA进入癌细胞，首先清除了老年血清中的脂质或大于3kda的分子，发现这导致血清MMA水平显著降低，由此表明MMA与血清中大于3 kDa的脂质结构复合，从而有助于其进入癌细胞。接下来作者发现MMA与合成的脂质体或从胎牛血清（FBS）纯化的脂质结构复合，都能将诱导前侵袭性所需的MMA浓度降低到与老年供体血清相似的水平。用从老年血清而非年轻血清中分离出来的脂质结构来治疗癌细胞，或从年轻血清中分离出来并以与老年血清中相似的浓度装载MMA，足以驱动肿瘤前侵袭特性。相反，老年血清中脂质结构的减少导致总血清MMA水平降低，足以消除肿瘤前侵袭表型。
将MDA-MB-231细胞原位注射到循环MMA水平升高的无胸腺小鼠的乳腺脂肪垫中（图2e），进一步证明循环MMA通过促进肿瘤生长和转移扩散并在肿瘤进展中发挥重要作用，同时上述肿瘤模型的生存率显著下降（图2f-h）。以上数据表明，与脂质结构复合的MMA是一种循环因子，有助于促进癌细胞衰老的前侵袭性作用，并足以推动肿瘤的进展和侵袭性。
图2. MMA诱导肿瘤细胞的侵袭性
为了研究MMA如何促进细胞可塑性，作者用MMA处理为期10天的A549细胞并进行转录组分析，发现MMA诱导了显著的转录重编程。基因集富集分析（GSEA）显示MMA能够正向调控转录，为了找到相关的转录调节因子，在MMA治疗的早期（第3天）再次进行转录组分析发现了439个诱导基因，且有11个编码转录因子，9个经qPCR验证后发生显著变化，其中SOX4基因的表达水平最高。已有研究表明SOX4是一种不良预后的标记物，有助于肿瘤进展和转移形成，在各种侵袭性癌症中异常高表达，并被认为是EMT的主要调节因子。
在不同浓度MMA处理的各种细胞模型及用老年血清培养的细胞中，SOX4水平均显著升高（图3a, b），可见SOX4介导前侵袭表型。为了更好地阐述MMA与SOX4的关系，作者使用短发夹RNA （shRNA）抑制SOX4的表达。当SOX4表达被抑制时，MMA无法上调一些基因的mRNA水平。此外，SOX4的抑制阻断了MMA或老年血清诱导EMT和侵袭性标志物的能力。最后，SOX4的耗竭完全消除了MMA促进迁移和侵袭特性的能力、对化疗药物的抵抗力以及用MMA或老年血清处理后MDA-MB-231-荧光素酶细胞在无胸腺小鼠肺中形成集落的能力（图3c，d）。可见MMA通过SOX4诱导促进前侵袭性转录重塑。
下一步试图了解MMA如何改变SOX4水平。在癌细胞模型中，MMA治疗并没有改变主要组蛋白修饰的总水平。另外，TGFβ通路调节SOX4水平，RNA-seq分析显示TGFβ信号通路的几个成分配体（如TGFβ-2）增加。作者证实了TGFB2 mRNA的增加与MMA处理的癌细胞培养基中TGFβ-2的丰度随时间的增加相关（图3e）。对循环MMA水平升高的小鼠肿瘤组织进行分析显示，TGFB2 mRNA显著上调，TGFβ信号传导同时诱导SOX4上调（图3f，g）。为了测试TGFβ信号的激活是否与SOX4的上调有关，同时用MMA和TGFβ受体抑制剂或TGFβ中和抗体治疗癌细胞。在培养基中抑制TGFβ受体和中和TGFβ配体足以阻止MMA诱导SOX4表达和前侵袭性特性（图3h）。这些数据表明MMA依赖于以自分泌方式激活TGFβ信号来诱导SOX4，从而产生维持肿瘤进展细胞可塑性所必需的转录重编程。
图3. MMA通过激活TGFβ后诱导SOX4信号通路以激活前侵袭性转录重编程
本研究结果表明老年宿主的代谢失调在肿瘤进展的侵袭性中起着核心作用，衰老促进循环MMA的增加，从而赋予癌细胞迁移、入侵、生存和发展所需的属性，形成转移性病变，从而降低癌症相关的生存率。MMA诱导SOX4表达，从而诱导转录重编程，进而赋予癌细胞侵袭性特性。本研究揭示了MMA的积累导致衰老和癌症进展之间的联系，提示MMA是治疗晚期癌症的潜在靶点，同时将代谢重编程用于研究衰老与癌症之间的复杂关系。
参考文献
Ana P. Gomes, et al. Age-induced accumulation of methylmalonic acid promotes tumour progression, Nature. 2020. https://www.nature.com/articles/s41586-020-2630-0.