灭活疫苗、减毒疫苗和基因工程疫苗
灭活疫苗是疫苗中使用得比较普遍和研究过程较为简单的一种。它是将死亡的病毒输入人体中，促使人体产生抗体。当人们再遇到活的病毒时就不会感染。
研究灭活疫苗首先要鉴定病原，找到病毒，并在实验室里培养出大量的病毒。提纯后再通过化学方法灭活，也就是“杀死”它们，做成灭活疫苗。然后将灭活疫苗（死的病毒）输入动物做免疫实验，判断疫苗的安全性；如果安全性没有问题，还得做效力实验，即把活的病毒输入已注射疫苗的动物体内后，如果动物没有生病或死亡，则说明产生了抗体并起到了作用。动物实验还包括各种毒副作用实验，实验成功后才能考虑在临床上使用。
想做出一个效果好的疫苗，整个过程仍然需要不少时间。就拿动物安全实验来说，一种安全有效的疫苗必须在敏感动物身上做安全实验和效力实验，人用疫苗还必须用灵长类动物做上述实验，仅这一项实验至少需要几个月时间。
和其它种类的疫苗相比，灭活疫苗研制的周期最短，方法也最简单。
灭活疫苗常用灭活剂
β-丙内酯(β-PL)：广泛用于病毒及灭活疫苗的研制和生产。做灭活剂使用。如用β-丙内酯应使用95%以上浓度的新试剂，β-丙内酯保存时间过长引起自身聚合，影响灭活效果。我国制备狂犬病疫苗时采用甲醛溶液灭活，甲醛为致癌物，残留的游离甲醛随疫苗注入人体后产生制激性反应。β-丙内酯由于能在疫苗液体中完全水解，不必考虑在成品疫苗中的残留，因此可考虑在纯化前低剂量预灭活一次，提高生产工序时的安全性，在纯化后再灭活一次以确保完全灭活.
BPL在国外已广泛用于各种疫苗的灭活。它是一种杂环类化合物(C3H4O2)，沸点155℃，常温下是无色粘稠状液体，对病毒具有很强的灭活作用，其机理为改变病毒RNA结构达到灭活目的。β-丙内酯杀灭病毒的作用很强，1 g/L β-丙内酯，在37℃作用2小时后即可杀灭血浆 中的 西方马脑炎病毒、东方马脑炎病毒、淋巴脉络丛脑炎病毒、圣路易脑炎病毒、狂犬病病毒等 。到目前为止，以流感病毒、猪瘟病毒、腺病毒、乙肝病毒、痘病毒、黄热病毒、微小RNA 病毒、疱疹病毒、东方马脑炎病毒、西方马脑炎病毒、委内瑞拉脑炎病毒、狂犬病病毒、鼠 脑炎病毒等作试验，β-丙内酯气体均能有效地将其杀灭，一般认为，β-丙内脂气体杀 灭病毒的有效浓度为5～30mg/L。低浓度的β-丙内酯(2～4 mg/L)可以破坏病毒核酸，但不改变病毒蛋白质，因此也是灭活疫苗 制造中很常用的病毒灭活剂。实践中应根据病毒材料的种类 和状态，应用正确浓度、使用方法、作用时间、温度等等。
甲醛和戊二醛
甲醛及其37～40％溶液即福尔马林，是病毒学中普遍应用的一种病毒灭活 剂，在灭活疫苗的制造中尤为常用。甲醛对病毒核酸和病毒蛋白质都有破坏作用，但首先 是使 病毒核酸灭活——与腺嘌呤、鸟嘌呤和胞嘧啶等含有胺基的碱基结合而使病毒核酸变性。甲 醛较高浓度和较长时间的作用，可与病毒蛋白质的胺基结合而形成羟甲基衍生物或二羟甲基 衍生物，后者再与酰胺发生交联反应。病毒蛋白质因而变性，阻止病 毒核酸的逸出。
甲醛对单链核酸最为有效 ，故常用于RNA病毒的灭活。适当浓度的甲醛灭活病毒后，病毒抗原性、血凝性均不改变，故常用其灭活病毒制造疫苗， 迄今应用的灭活病毒疫 苗，约有50%以上是用甲醛作灭活剂，通常应用0.05%～0.1%～0.2%浓度的福尔马林。其 它病毒制品如血凝抗原、补体结合抗原、琼扩抗原也常以甲醛灭活病毒制备。
戊二醛对病毒的作用与甲 醛相似，但灭活作用更强，2%碱性戊二醛溶液在1分钟内能杀灭所有病毒。在病毒学中，戊 二 醛常用于实验室污染器材如超净工作台、离心机的擦拭消毒。用强化酸性戊二醛(含0.25 乙烯脂肪醇醚)代替常用的3%～5%石炭酸溶液浸泡污染的吸管、试管等，具有可靠的消毒效果。
病原菌的分离鉴定及其疫苗的制备
一、实验目的
熟悉水产细菌性病原的分离、培养、纯化与鉴定的基本方法，了解所分离细菌性病原的形态特征及培养特点，了解细菌性灭活疫苗制备的基本过程。
二、实验材料
患白内障病虎纹蛙（或其他患细菌性疾病的水产动物）、健康虎纹蛙、脑膜炎败血黄杆菌（虎纹蛙白内障病的病原）
三、实验药品、用具
2216E 琼脂平板、 2216E 琼脂斜面、福尔马林、无菌蒸馏水、生理盐水、磷酸缓冲液、接种环、解剖刀、剪刀、镊子、滴管、纱布、白瓷盘、酒精棉球、灭菌试管、 96 孔板、注射器、酒精灯、离心机（包括离心管）、水族箱、记号笔、
四、实验操作程序
（一）病原菌的分离与鉴定
1 ．培养基的制备
（ 1 ）普通肉汤培养基：
按以下剂量称取各种试剂（先称取盐类再称蛋白胨及牛肉膏），置于铝锅或搪瓷缸中。
牛肉膏 5g 磷酸氢二钾 1g
蛋白胨 10g 蒸馏水 1000ml
氯化钠 5g pH 7 . 4 ～ 7 . 6
初配好的培养基呈酸性故要用 NaOH 调整。将 pH 测定后的肉汤培养基用滤纸过滤，将过滤好的肉汤分装试管、盐水瓶、三角烧瓶等容器，待灭菌。
（ 2 ）普通营养琼脂培养基
普通肉汤 1000ml
琼脂 20g
琼脂是由海藻中提取得一种多糖类物质，对病原性细菌无营养作用，但在水中加温可融化，冷却后可凝固。在液体培养基中加入琼脂 1 . 5 ～ 2 ％即可固定培养基，如加入 0 . 3 ～ 0 . 5 ％则成半固体培养基。
将称好的琼脂加到普容肉汤中，加热煮沸，待琼脂完全融化后，将 pH 调至 7 . 4 ～ 7 . 6 。琼脂融化过程中需不断搅拌，并控制火力，不使培养基溢出或烧焦，并注意补充蒸发掉的水份。
加热溶解好的培养基可用滤纸进行过滤，固体培养基要用 4 层纱布趁热过滤（切勿使培养基凝固在纱布上），之后按实验要求，将配制好的培养基分装入试管或三角瓶中，包扎好待灭菌，将培养基置于高压蒸汽锅内， 121 ℃ 灭菌 15 ～ 30min ，趁热将试管口一端搁在玻棒上，使之有一定斜度，凝固后即成普通琼脂斜面，也可直立，凝固后即成高层琼脂。
盐水瓶中的普通琼脂以手掌感触，若将瓶紧握手中觉得烫手，但仍能握持者，此即为倾倒平皿的合适温度（ 50 ～ 60 ℃ ），每只灭菌培养皿倒入约 15 ～ 20ml ，将皿盖盖上，并将培养皿于桌面上轻轻回转，使培养基平铺于皿底，即成普通琼脂平板。
培养基中的某种成分，如血清、糖类、尿素、氨基酸等在高温下易于分解、变性，故应过滤除菌，再按规定的量加入培养基中。
2 ．病原菌的分离与培养
分离病原菌的材料要求是具有典型患病症状的活的或刚死不久的患病生物，病原菌的分离方法如下。
体表分离：先将病灶部位表面用 70% 酒精酒精棉球擦拭消毒或取病灶部分小片或 用经酒精灯灼烧的解剖刀烫烧消毒，再 用接种环刮取病灶深部组织或直接挑取部分深部患病组织，接种于普通肉汤培养基增菌或直接在普通琼脂平板上划线分离。
内部组织器官：用 70 ％酒精浸过的纱布覆盖体表或用酒精棉球擦拭，进行体表消毒，无菌打开病鱼的腹腔，以肝、肠、心脏等脏器为材料， 先将拟分离病原的部位表面用 70% 酒精棉球擦拭或用 经火焰上灼烧后的解剖刀烫烧，以杀死表面的杂菌，随即在烧灼部位刺一小孔，用灭菌的接种环（待冷 2 ～ 5 秒）伸向烧灼部小洞中，用手指将接种环轻轻旋转两次，借以达到取足材料的目的。左手持握普通琼脂平板，并靠近火焰，右手持取材后的接种环在琼脂平板上分区划线接种。划线时接种环面与平板表面成 30 ～ 40 度的角轻轻接触，在平板表面轻快地移动，接种环不应嵌入培养基内，且不要重复，否则形成菌苔。划线完毕，盖上皿盖，接种环灭菌后放下，并在平皿底部用记号笔注明接种材料、日期及操作者代号。也可对实质性脏器用无菌剪刀下一小块，用镊子夹住病料使其剖面接触洁净的玻片，作多个触片，染色后在显微镜下直接镜检，能快速获得结果。
鳃部：用无菌接种环刮取鳃上的分泌物划平板。
血液及体液：用无菌注射器吸取病鱼血液和体液，滴于平板涂布；或用灭菌后的接种环挑取血液和体液后于平板上划线，分离细菌。
接种后的平板经 30 ℃ 左右培养 24 ～ 72h 后， 检查菌落生长情况，对菌落检查的主要内容包括：
（ 1 ）大小：其大小以 mm 表示，微小菌落：针尖大，直径小于 0 . 5mm ，如支原体菌落、猪丹毒杆菌菌落；小菌落：直径在 0 . 5 ～ 1 mm 之间，如嗜血杆菌、布氏杆菌菌落；中等大小的菌落：直径在 1 ～ 3 mm 之间，如巴氏杆菌、沙门氏杆菌菌落；大的菌落：直径大于 3mm ，如炭疽芽孢杆菌菌落等。
（ 2 ）形态：圆形，不规则形（根状、树叶状）
（ 3 ）边缘：整齐，不整齐（锯齿状、虫蚀状、卷发状）
（ 4 ）表面：光滑、粘液状、粗糙、荷包蛋状、漩涡状、颗粒状
（ 5 ）隆起度：隆起，轻度隆起，中央隆起，平升状、扁平状，脐状（凹陷状）
（ 6 ）颜色：无色、灰白色、白色、金黄色、红色、粉红色
（ 7 ）透明度：透明、半透明、不透明
（ 8 ）溶血性： β －溶血（完全溶血）， α －溶血（不完全溶血），不溶血
根据菌落数量和特征，挑选可能的病原菌菌落进一步划线纯化 1 ～ 2 次后，将经纯化的可能病原菌用于感染试验。
3 ．病原菌的确定
将从患病材料中分离的所有可能病原菌经纯化和扩大培养后分别进行人工感染实验。目前最常用的人工感染接种方法有浸泡、口服和注射法等，究竟选用哪一种方法最合适，需要根据不同的疾病类型和可能的侵入途径而定。如体表的病，可采用浸泡法（包括创伤浸泡）；体内的疾病，可采用口服、注射法。由于绝大部分病原菌都是条件致病菌，因此在人工感染实验时还要注意感染菌的用量，接种量过大，即使该菌并不是引起实验材料致病的病原菌，也可能会因大量菌体裂解释放的大量内毒素而使感染生物死亡，为了量化感染菌的危害程度，可以测定感染细菌对接种动物的半数致死量（ LD 50 ），根据 LD 50 的大小来判断其致病力的强弱。只有 LD 50 相对较低、感染引起的死亡与实验材料有相同症状、并且经回接实验还能分离到相同的细菌时，才能确定所分离的细菌为引起实验材料致病的病原 。
在感染实验时，感染对象要求是 没有患病史的同种生物，在感染前要经过 1 ～ 2 周的暂养，感染数量要 30 尾以上（至少要 10 尾以上）。必要时，还要将温度控制在适合疾病爆发的水平 。感染过程中要 定时投饵和换水，同时安排合适的对照组。
4 ．病原菌的鉴定
分别观察病原菌的形态以及检测其各种生理生化指标，通过查阅伯杰氏手册确定病原菌的种类；也可直接用细菌鉴定仪测定病原菌的种类。
（二）疫苗制备
1 ．病原菌的扩大培养与分离
液体培养：按配方配制 2216E 液体培养基，将培养基用 三角烧瓶分装并盖上棉塞后置 于高压蒸汽锅内， 121 ℃ 灭菌 15 ～ 30min ，冷却后于超净工作台内加入 1ml 左右预先制备的病原菌菌液，盖上棉塞，用摇床于 28~ 30 ℃ 下震荡（约 150rpm ）培养 24~48h 。病原菌经扩大培养后以 3000~5000rpm 离心 20~30min ，取沉淀用 PBS （磷酸缓冲液）配制成 1% 或 1 ‰左右 的菌悬液。
茄子瓶扩大培养：按配方配制 2216E 琼脂培养基，于高压蒸汽锅内， 121 ℃ 灭菌 15 ～ 30min ，趁热倒入经干热消毒的茄子瓶内（每瓶约 15ml 培养基），茄子瓶用消毒棉塞封口后平放于超净工作台台面，稍予摇动使培养基平铺于瓶壁，冷却后制成茄子瓶平板。用无菌滴管吸取预先制备的病原菌菌液，在每个茄子瓶平板表面滴加 3~4 滴，再用经灼烧消毒并冷却的玻璃涂布器将菌液涂布均匀， 28~ 30 ℃ 下培养 24~48h 。用无菌 PBS 洗脱平板表面的菌苔，洗脱液经 3000~5000rpm 离心 20~30min ，取沉淀用 PBS （磷酸缓冲液）配制成约 1% 或 1 ‰ 的菌悬液。
2 ．灭活
化学灭活：以福尔马林作为化学灭活剂。灭活前先确定福尔马林对该病原菌的安全灭活浓度，确定方法为：取 7 支灭菌试管，分别 5ml 加入预先制备病原菌菌液，其中 6 支装有菌液的试管分别依次加入一定量的福尔马林，使福尔马林的终浓度分别为 0.1% 、 0.2% 、 0.4% 、 0.6% 、 0.8% 、 1.0% ，另 1 支试管不加入福尔马林作为对照；于 4 ℃ 下放置 24h 后，于每支试管中分别取 0.2ml 菌液于 2216E 琼脂平板上涂布， 28~ 30 ℃ 下培养 48h ，检测各试管内细菌的存活情况，只有没有细菌生长的对应福尔马林浓度才是该病原菌的灭活安全浓度。向第 1 步中制备的 1% 菌悬液内添加福尔马林，使福尔马林的最终浓度达到安全灭活浓度以上， 于 4 ℃ 下放置 24h ，制备灭活菌液。
其他灭活方法：除化学灭活，疫苗制备时还可采用热灭活、紫外线和超声波灭活等方法。
3 ．安全性检测
活性检测：取 0.2ml 灭活菌于 2216E 琼脂平板上涂布， 28~ 30 ℃ 下培养 48h ，只有在琼脂平板上没有出现菌落出现才说明灭活彻底，灭活菌液中确实没有活菌存在。
安全检测：将所制备的灭活菌液稀释成疫苗接种所用的浓度（一般为 10 8 cfu ），用注射法将稀释后的灭活菌液接种到无患病史的同种寄主动物（水产养殖动物）体内，经 20d 观察无发病或死亡才说明该灭活细菌是安全的。
4 ．效果检测
抗体效价检测：用注射法将稀释后的灭活菌液接种到 无患病史的同种寄主动物（水产养殖动物）体内，连续养殖 2 个月，从第 10d 开始每隔 10d 取 3 尾以上接种生物用 微量血凝板法检测其平均凝集抗体效价 。抗体效价检测方法为：抽取感染动物血液并离心分离血清，用取样器吸取 0.1ml 血清加入经灭菌的 96 孔板的 A1 孔内，在 96 孔板 A 行的其他孔内加入 0.05ml 无菌 PBS ，从 A1 孔内取 0.05ml 血清加入 A2 孔内，混匀后再从 A2 孔内取 0.05ml 液体加入 A3 孔内 …… ，如此重复，使 96 孔板内后 1 个孔内的血清浓度均比前 1 个孔低 1 倍（倍释法），再在 96 孔板的每个孔内加入 0.05ml 菌液（活的或灭活的均可）， 37 ℃ 孵育过夜后观察（最好在 96 孔板下垫一张黑纸以增加反差），出现沉淀的最高血清稀释倍数即为血清中所含抗病原菌抗体的效价。比较不同时期内抗体效价的变化情况，确定最高抗体效价值。一般情况下，抗体效价越高，灭活细菌作为疫苗的效果就最好。
攻毒感染实验：选择 无患病史的同种同龄寄主动物（水产养殖动物）作为感染对象，用注射法进行攻毒感染。 用注射法将稀释后的灭活菌液接种到 无患病史的同种寄主动物（水产养殖动物）体内，连续养殖 2 个月，从第 20d 开始每隔 20d 取 10 尾以上接种生物用 活的病原菌进行感染，感染方法为： 。
（二）致病菌的人工感染
1) 实验材料：嗜水气单胞菌斜面（每组 2 支），试管架（ 1 个）酒精棉球（ 1 瓶），无菌生理盐水，灭菌空试管，麦氏比浊管。
2 ）实验方法：用装有针头的注射器（或无菌吸管），吸取无菌生理盐水，滴注到培养有嗜水气单胞菌的斜面上，振荡使斜面上的菌落洗下（或用灭菌接种环轻轻刮下），倒入灭菌空试管中，用无菌生理盐水稀释调节菌浓度，与麦氏比浊管进行比色，使菌浓度达到 2.1×10 9 个细菌 /ml （ 21 亿），用灭菌注射器抽取菌悬液，待人工感染时用。注射部位在鱼的背鳍前端与侧线之间的中部区域。用酒精棉球在注射部位擦拭进行体表消毒后进行肌肉注射。针尖斜向鱼的头部，与鱼体成 30° 左右的角度插入肌肉，注射深度在 1 ～ 1.5 cm 。每尾鱼注射量为 0.6 ml ，每天观察鱼的发病及症状等情况并做好记录。
第一节 病毒的生产制备
病毒需在活的敏感细胞中才能增殖，在细胞培养技术不成熟之前，人们为研究病毒，往往采用鸡胚接种或动物接种的方法来分离、鉴定病毒或制备一定量的病毒液，但这种方法因个体和种属差异，不仅许多病毒难以找到合适的敏感动物，而且即使在敏感动物中繁殖，往往个体差异大而影响结果的判定，随着细胞培养技术的发展，首先在病毒学研究方面获得了广泛的应用，为病毒的繁殖、鉴定提供了来自不同动物（包括人）、不同组织的细胞来源，通过敏感性筛选，目前绝大多数病毒均可有相应的敏感细胞，为病毒的分离、鉴定和增殖创造了条件。同时也为病毒的大量生产提供了细胞来源，随着细胞大量生产技术的发展，因此对病毒来说只要有敏感的细胞，就可以进行大规模生产。
一、病毒生产的目的和用途
1、为了制备大量的病毒抗原，以制备病毒的亚单位疫苗或表面抗原疫苗，或用病毒抗原制备免疫血清（抗体）。
2、为了制备病毒的减毒活疫苗或灭活的死疫苗，以用于预防接种。
3、为了生产基因改造后或重组有其它多肽因子的病毒，以用于基因治疗或杀肿瘤治疗及基因疫苗的预防接种。
4、为了制备干扰素的病毒诱生剂（NDV、仙台病毒等），用于干扰素的生产。
5、生物战用的病毒生物战剂。常选用毒力强、抵抗力强、对不同国家人群最敏感的病毒，又能通过气溶胶或昆虫和污染的水土进行传播的病毒。这是战争狂们正在开展的研究，应警惕。
二、病毒生产制备的方法
1、动物接种，如狂犬病毒、脑炎虫媒病毒采用鼠、兔脑内接种后收取脑组织制成悬液。
2、鸡胚、鸭胚接种：如流感病毒、副流感病毒（NDV-F）、仙台病毒等，目前尚无敏感细胞，常采用9～10日胚龄的尿囊腔接种，37℃孵育72小时收获尿液，用鸡红血球测定血凝效价。Q热用7日龄鸭胚进行卵黄囊接种收获卵黄囊，马脑炎病毒常采用10日龄鸡胚体接种，收获全胚体液等。
3、细胞培养法（详见第二篇第18章）
不同的病毒选用相应的敏感细胞，采用转瓶培养、多层培养、微载体培养或悬浮搅拌培养等方法,先大量增殖细胞，然后接种一定量的病毒,继续培养适当时间时，冻融细胞后，离心收获上清。
以上病毒大量生产后可制作病毒疫苗（死疫苗或减毒活疫苗），也可用来作干扰素诱生剂或提取病毒表面抗原成分，但反对用作生物战剂，危害人类健康和生命。
第二节 病毒疫苗的生产制备
病毒疫苗的生产制备与病毒的生产制备基本相同，目前进行人工主动免疫，用于病毒病预防的疫苗有灭活疫苗（Killed Vaccine）,又称死疫苗，减毒活疫苗（Live Vaccine）,亚单位疫苗，多肽疫苗、基因缺失的减毒活疫苗，基因工程亚单位疫苗，重组牛痘多价疫苗。
一、病毒疫苗的种类
(一)灭活疫苗：目前常用的有流行性乙型脑炎疫苗，狂犬病疫苗（二倍体细胞与地鼠肾细胞可用于生产狂犬病病毒固定毒灭活疫苗），流感灭活疫苗。常用甲醛为灭活剂，以灭活病毒核酸而不影响其抗原性。
(二)减毒活疫苗，通常采用自然法或人工法，通过动物传代或细胞传代筛选对人毒力低的变异株病毒。常用的有脊髓灰质炎疫苗、麻疹疫苗、流感温度敏感突变株疫苗、流行性腮腺炎疫苗、风疹疫苗、黄热病疫苗以及一些联合疫苗（如麻疹、腮腺炎、风疹联合疫苗）。
(三)亚单位疫苗：用化学试剂裂解病毒，提取包膜或衣壳上的亚单位，除去其核酸，以此制成的疫苗称亚单位疫苗。如流感病毒的包膜提取后制成的血凝素和神经氨酸酶亚单位疫苗。
(四)多肽疫苗：采用乙肝携带者血提取的HBsAg的乙型肝炎疫苗或采用基因工程法制备的HBsAg基因表达产物制备的疫苗。
(五)基因缺失的减毒活疫苗：在病毒的基因组中，使其有毒力的相关基因发生缺失而制成的减毒活疫苗称基因缺失的减毒活疫苗，如狂犬病毒的胸苷激酶（TK）缺失株（第一代）和gp3区缺失株（第二代），单纯疱疹病毒的α22基因缺失株，目前有待进一步研究。
(六)基因工程亚单位疫苗：将病毒表面抗原基因，通过基因重组，在酵母或CHO细胞中进行表达亚单位多肽抗原成分而制成的疫苗，称基因工程亚单位疫苗，如乙型肝炎病毒的表面抗原HBsAg的基因在酵母和CHO细胞中表达而提取获得的纯品HBsAg多肽。即将上市。
(七)重组牛痘多价活疫苗。以牛痘苗为载体来表达数十种外源性病毒抗原基因，如：HAV、HBV、麻疹病毒、I型和II型HSV、EBV，狂犬病毒等抗原基因，经基因重组后而制成的牛痘苗病毒，经一次划痕接种可使机体同时能获得对多种病毒的免疫力，大大减少了接种次数。此外腺病毒和脊髓灰质炎病毒的活疫苗也可作为载体与轮状病毒的抗原基因重组后的活疫苗，经口服后可同时获得两种病毒的免疫力，有待于进一步研究、开发。
上述病毒疫苗有的是采用细胞培养技术和细胞工程来进行生产制备的，现将采用细胞工程制备病毒疫苗种类和敏感细胞以及生产方式规于下表。
二、细胞培养法制备的常用疫苗（如表25-1）。
表25-1 采用细胞培养法生产的常用病毒疫苗
疫 苗 制备疫苗
的 细 胞 培养方法
名 称 活/死(疫苗株)
脊 髓 灰 灭活（Salk株） 猴肾细胞（原代/2-3代） 转瓶培养
质炎疫苗 活（Sabin株） Vero细胞 微载体培养
腮 腺 炎 活（ME株） 幼地鼠、狗肾 转瓶培养
疫 苗 豚鼠肾细胞 罗氏瓶培养
麻疹活疫苗 Edomonste、
L16、沪191、
Moraten、
Schwar2株
原代鸡胚纤维母
细胞，人二倍体
人羊膜、狗肾、羊肾
豚鼠肾细胞
罗氏瓶培养
转瓶培养
单纯疮疹 死（72株） 兔肾、豚鼠肾 罗氏瓶培养
病毒疫苗 豚鼠胚成纤维细胞 转瓶培养
巨细胞病毒疫苗 活（Towne株） WI-38人胚肺细胞 转瓶培养
狂犬病毒疫苗 死（**01/**02株）
（CUS株） 人二倍体细胞 微载体培养
流行性乙型
脑炎疫苗 灭活（5-3株） 人二倍体细胞 多层滋养增殖器
森林脑炎
病毒疫苗 灭活 鸡胚纤维母细胞
幼地鼠肾细胞 转瓶培养
三、用细胞培养制备病毒疫苗的优点：
病毒疫苗的制备开始多用动物脏器、禽类胚胎（第一代疫苗）。然而因来源困难，很不经济，制作麻烦，数量受限，更危险的是这些组织中间可能含有潜在致癌病毒和慢性病毒，后改用原代细胞来制作疫苗（第二代疫苗），如麻疹疫苗、乙脑疫苗等，随着细胞培养的发展，特别是自70年代后我国二倍体细胞株相继建立，为疫苗生产创造了极为有利的基础，这比用原代细胞制备疫苗更优越。如：
（1）在细胞传代期间可进行比较全面的检查，特别是对潜在病毒和致癌性的检查，确保安全。
（2）可使逐渐适应于无血清（或无蛋白）培基中生产繁殖，以排除过敏因素。
（3）可挑选对病毒敏感的细胞克隆。以利病毒在细胞中大量增殖，有助于疫苗产量的提高。
（4）易于大量生产和进行连续自动化工业生产，以满足量的需求。
国外已建立的二倍体细胞WI-38、MRC-5、IMR-90等，国内已建立KMB-17、2BS、SL-7等均已用于疫苗生产，如麻疹活疫苗、乙型脑炎疫苗、脊髓灰质炎疫苗、腮腺炎疫苗等，从目前发展来看，用二倍体细胞制备疫苗将有取代其他原代细胞和传代细胞的趋势，但目前仍有一些病毒疫苗的制备还需用原代细胞，近年来有人主张用肿瘤细胞制备人用灭活疫苗。
四、提高疫苗的效力常采用的方法：
（1）细胞的药物处理：用某些药物处理细胞后可以刺激病毒繁殖（如下表），其方法为：在细胞形成单层后，用一些化学药物来处理，然后洗去，再接种病毒，就可使病毒提前成熟，产量高，现列表如下：
处理细胞的药物 刺激的病毒
5-碘-2-脱氧尿核甙 风疹、腺病毒、巨细胞病SV-40
维生素A或Tween-80 脊髓灰质炎病毒、滤泡性口腔炎病毒
胆固醇或卵磷质 脊髓灰质炎病毒
DEAE-dextran 脊髓灰质炎病毒、风疹痘类病毒，付流感病毒
胰 酶 痘类病毒、呼吸道肠道病毒，流感病毒、鼻病毒
二甲亚砜 脊髓灰质炎病毒、流感、疱疹病毒
放线菌素D 麻疹、脊髓灰质炎病毒、付流感病毒
（2）在维持液中补充某些物质也有利于某些病毒的复制、列表如下：
增 加 的 药 物 刺 激 的 病 毒
Tween-80或油酸钠 乙型脑炎
谷氨酰胺 麻疹、脊髓灰质炎病毒、仙台病毒
精氨酸 痘类病毒、疱疹病毒
脯氨酸、赖氨酸 乙型脑炎
（3）毒种的选择：经过空斑挑选产量高的大空斑毒株，精制毒种可提高病毒产量。
（4）病毒液的浓缩：经浓缩后，病毒浓度增高，从而效价也随之上升。
五、影响疫苗质量的因素：
（1）毒种：毒种的优劣不仅影响疫苗的产量，而且也影响疫苗的质量，毒种不纯会产生相互干扰，减毒活疫苗毒种若毒力回升易造成事故，因此毒种的选择应挑选那些致病性低，免疫效价高而持久，抗原谱广的，易增殖，便于生产，可在传代细胞上传代的毒种。
（2）培养病毒的细胞：细胞若有潜在的致癌性病毒或慢病毒，以及有支原体污染均不能用作疫苗生产。对此因素应严格检查。此外若细胞本身发生转化后，不宜于制备活疫苗，只能制备一些灭活疫苗或亚单位疫苗。
（3）培养液：培养细胞的营养液中多少含有一定量的血清蛋白，在疫苗使用中常会出现某种程度的过敏反应，为此，应尽量使细胞适应于无血清蛋白的培养基中，以消除过敏源。
（4）甲醛灭活剂的使用：甲醛能使病毒灭活，但仍保持其抗原性，因此普遍用来制备灭活病毒疫苗，但要控制含量。
病毒被灭活的程度与灭活的温度和甲醛的浓度等因素有密切关系。一般用热灭活的方法，采用在37℃灭活一定时间。经热灭活疫苗，不但其免疫原性、免疫效力和稳定性不受影响，而且灭活病毒的温度提高以后，灭活时间相对可以缩短，灭活剂的用量也可以减少。
甲醛能刺激局部而引起疼痛和红肿，并有释放组织胺的作用。因此制备疫苗时减少甲醛浓度是必要的。如果疫苗内游离甲醛含量降低到一定程度后，可考虑不需再用亚硫酸氢钠来中和甲醛。这对减少注射后疼痛及便于推广预防接种有重要意义。
六、生产病毒和制备病毒疫苗的常用方法
(一)制备工艺流程
（1）脊髓灰质炎病毒活疫苗制备工艺
猴 肾 细 胞 培 养
←接种病毒（测0%正常细胞对照）
收获病毒，合并，加MgCl2→
无菌试验→ ←猴病毒检查（获肾细胞）（SV40）
B病毒检查（兔肾细胞）→ ←病毒效价滴定
←合并，过滤加MgCl2
←无菌试验
分亚批→ ←柯萨奇病毒检查（乳鼠）
病毒滴定→ ←型特异性检查
B病毒复检（家兔）→ ←T特征试验
分装病毒滴定→ ←猴体残余致麻痹力试验
（安全试验）病理切片
结核杆菌检查→
分装→ ←无菌试验
病毒滴定→
→ 保存于-20℃待检定合格后
加 工 糖 丸
脊髓灰质炎活疫菌工艺流程
2、流行性乙型脑炎病毒死疫苗制备工艺
地 鼠 肾
剪碎，胰酶消化
地鼠肾细胞悬液
37℃,3天 细胞培养液，pH7.0～pH7.2
单层细胞
洗涤细胞，去除牛血清
10-4～10-5浓度病毒感染细胞
32～34℃培养2～3天
收获病毒液（收二次）
按1:2000加入甲醛
22℃，8天
灭活病毒液
合并，安全及效力试验
原液
加入亚硫酸氨钠
半成品
分装
成品
检定(包括理化性质，无菌试验、安全试验，
防腐剂、试剂及残余牛血清含量等）
合格成品
(二)生产方法：
病毒和病毒疫苗的生产方法基本相同，其规模取决于细胞生产规模，因此上述介绍的细胞大量生产的方法和工艺均可用来生产病毒和病毒疫苗，可根据需要及适宜生产条件来选用培养装置，如转瓶培养，因设备简单，便于生产单位采用。而多层培养，微载体培养，目前国外已用于生产，我国仍在研究中。悬浮搅拌培养的简易装置已应用于疫苗生产，全自动悬浮发酵罐，在干扰素生产中有应用，但在疫苗生产中正在试用，下面着重介绍微载体培养法生产病毒的技术。
1、微载体悬浮培养细胞的病毒生产工艺
作者选VSV病毒来接种经微载体培养的敏感细胞，病毒的效价测定用A549细胞（也可用Wish或Hep-2细胞或鸡胚纤维母细胞测TCID50），病毒的效价为6 Log TCID50/m L，用鸡胚细胞空斑法测定一般为107Pfu/mL。
①VSV在方瓶贴壁细胞中的增殖（100mL方瓶，10mL培养基）待BHK21、BHK13、CHO-K1细胞长满单层，弃上清加入10-2VSV病毒悬液0.2ml，37℃吸附1小时，加病毒维持液培养20小时，于-30℃冻存，待测效价。
②VSV在微载体悬液培养的细胞中增殖。
微载体培养的BHK21或BHK13、或CHO-K1细胞，
3～4天后细胞密度已达1×106细胞/mL
静置30分钟
尽量吸去原培养基
37℃
将10-2VSV病毒按50mL培养体积加入1mL病毒液于微载体细胞中
37℃ 50r/min搅拌5分钟
静置吸附1小时（每20分钟搅拌2分钟）
加入病毒维持液至原体积
37℃继续搅拌培养20小时
于-30℃冻融后
2000 r/min 低温离心10分钟
收集上清，即为VSV增殖的病毒液，分装冻存，待测效价
结果，在微载体悬浮培养的三株细胞所繁殖VSV病毒不仅产量大，而且病毒效价平均高1LogTCID50，尤以CHO-K1效价最高，平均可达7.75logTCID50比原先的毒种效价还要高1.75LogTCID50，又起到了提高病毒效价的作用。
此方法也可应用于生产病毒疫苗，只要疫苗株病毒的敏感细胞能在微载体上大量生产。若疫苗株是减毒活疫苗株，此法生产的病毒可直接制备活疫苗。若疫苗株为非减毒活疫苗株，此法生产的病毒可用甲醛灭活法制备死疫苗。
2、转瓶培养法
此法是目前各大生物制品研究所常用于生产疫毒疫苗的方法，如生产脊髓灰质炎病毒疫苗，麻疹疫苗等。
将细胞制备成悬液后，在温室内（37℃）使支架以8～12转/小时缓慢转动，以使细胞贴壁，当加入病毒后，待细胞出现+++以上细胞病理性改变(CPE)时，标志病毒已大量繁殖，此时收获病毒，按生物制品程序加工成疫苗。
3、罗式瓶培养
将许多大罗氏瓶，在净化室内，把制备好的细胞悬液人工加入瓶内，100mL/瓶，在温室内的货架上一排排放置，进行静置贴壁培养，待细胞呈单层后，倒去旧液，加含病毒疫苗株和维持液，继续静置培养，每天观察细胞和记录温室的温度，待细胞有明显的CPE产生时，收获病毒液，然后按疫苗生产加工工艺制成疫苗。
以上2、3两种方法是我国各大生物制品所常规方法，由于制品工艺的要求，目前仍然采用，但正在不断改进和采用新工艺、新方法和高技术来生产疫苗。