原代细胞分离常采用的方法

原代细胞分离常采用的方法有以下两种：

一、悬浮细胞的分离法

1、将血液、羊水、胸水或腹水等悬液直接转至离心管中，1000rpm/min的低速离心5分钟；

2、去掉上清，离心沉淀用无钙、镁的PBS清洗后1000rpm/min离心5分钟。此步重复两次；

3、用培养基重悬，调整适当细胞浓度后分瓶培养；

4、如选用悬液中某种细胞，可采用离心后的细胞分层液收获目的细胞。

二、机械分散法

适合的组织：纤维成分较少的脑组织、部分胚胎组织、以及一些肿瘤组织等，但是这一方法对组织的损伤较大。

过程：用PBS清洗两次后，

(1)  剪刀剪碎切后用吸管反复吹打，分散组织细胞；

(2)  将已充分剪碎分散的组织放在注射器内(用九号针)，使细胞通过针头压出；

(3)  或在不锈钢纱网内用钝物压挤(常用注射器钝端)使细胞从网孔中压挤出。

原代细胞培养基本和常用的是组织块法和消化法

一、组织块培养法

处死动物，无菌取组织块入校烧杯内，用尖嘴眼科剪刀将组织块剪碎，吸管吸取PBS液冲下剪刀上的碎片，补加PBS，用吸管轻轻吹打，低速离心，弃去上清液，留下组织块，然后接种于培养瓶。

二、消化培养法

用消化液将妨碍细胞生长的细胞间质包括基质、纤维等去除，使组织松散、细胞分散形成悬液。

消化过程中常用的消化液：

1、胰蛋白酶

胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。

在 pH 为 8.0 、温度为 37℃时，胰酶溶液的作用能力强。

2、胶原酶

胶原酶（collagenase）是从溶组织梭状细胞芽孢杆菌提取制备的，主要水解结缔组织中胶原蛋白成分。当拟消化的组织较硬，内含较多结缔组织或胶原成分时，用胰蛋白酶解离细胞的效果较差，这时可采用胶原酶解离细胞法。

胶原酶仅对细胞间质有消化作用而对上皮细胞影响不大。因此适于消化分离纤维性组织、上皮及癌组织，可使上皮细胞与胶原成分分离而不受损害。

胶原酶分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型以及肝细胞专用胶原酶，要根据所要分离消化的组织类型选择胶原酶类型。

a、胶原酶Ⅰ用于上皮、肺，脂肪和肾上腺组织细胞的分离。用于消化组织中连接部分使其成为单个细胞，用于哺乳动细胞的分离；

b、胶原酶Ⅱ适用于肝脏，骨，甲状腺，心脏和唾液腺组织；

c、胶原酶Ⅳ包含至少7种蛋白酶成分，分子量从68-130KD不等。它能消化多种组织；

d、胶原酶Ⅴ包含至少7种蛋白酶成分，分子量从68-130KD不等。它可用于胰腺小岛组织的分离，将结缔组织分离成单个细胞。

下面让我们举几个实例：

正常大鼠心肌成纤维细胞培养（组织块法）：

1、将取出的心脏组织至于无菌的培养皿中用含双抗的1×PBS（pH=7.4）清洗若干次至无明显血细胞；

2、剪开心脏组织的心房和心室部分，用含双抗的1×PBS（pH=7.4）清洗若干次以去除心脏内部的大部分血液；

3、将清洗好的心脏组织剪成2mm3大小，加入含双抗的1×PBS（pH=7.4）清洗；然后转入15ml离心管，300r/min,离心3min后弃上清液。重复2-3次，直至离心后的液体中观察不到明显的红色。

4、将清洗好的组织块重新转至无菌的培养皿中，用无菌的200ml的吸头将组织块贴于T-25培养瓶中；

5、加入2ml培养基，将培养瓶倒置放于37℃、5%CO2的培养箱中2-3h之后，翻转培养瓶，继续培养。

大鼠肾小管上皮细胞培养（消化法）：

1、无菌条件下摘取大鼠肾脏，于盛有含双抗的1×PBS（pH7.4）的培养皿中冲洗，用眼科剪将肾脏被膜充分剥离。

2、去掉肾髓质，切取外层皮质于培养皿中，并用眼科剪将其剪碎至1mm3左右大小。

3、用含双抗的1×PBS（pH7.4）充分冲洗2-3次。

4、肾小管节段至离心管中离心300rpm 3min。

5、弃上清，沉淀加入0.25%胰蛋白酶，置于37℃水浴锅中消化20min。

6、加入1mlFBS终止反应。

7、取上清液，过200目网筛后收集液体，于1000rpm离心5min。

8、弃去上清，收集沉淀，加入培养基进行细胞重悬。

9、将细胞以合适的数量接种于培养瓶中。

10、将细胞放入37℃，5%CO2培养箱内培养，并于72h后进行次换液，以后每48h换一次液，直至细胞汇合铺满整个培养瓶。

当然，实际操作过程中，有时候一些细微的疏忽或差异都有可能影响到细胞的状态。我们很多人都遇到过这样的情况，当你花了很多心血分离或培养一瓶原代细胞，到了****它却弃你而去，丝毫不管不顾你的截止时间已经近在眼前，当你欲哭无泪肝肠寸断的时候，请不要忘了你还可以直接从专业公司寻求原代细胞。