冻存细胞方法及步骤

一、资料

（一）仪器 　　1. 净化作业台 　　2. 离心机 　　3. 恒温水浴箱 　　4. 冰箱（4℃、-20℃、-70℃） 　　5. 倒置相差显微镜 　　6. 培育箱 　　7. 液氮冰箱

（二）玻璃器皿 　　1. 吸管（弯头、直头） 　　2. 培育瓶 　　3. 玻璃瓶（250ml、100ml） 　　4. 废液缸

（三）塑料器皿 　　1. 吸头 　　2. 枪头 　　3. 胶塞 　　4. 移液管（10ml） 　　5. 15ml离心管 　　6. 冻存管（1～2ml）

（四）别的物品 　　1. 微量加样枪 　　2. 红血球计数板 　　3. 记号笔 　　4. 医用橡皮膏 　　5. 移液枪

（五）试剂 　　1. D-Hanks液 　　2. 小牛血清 　　3. 培育液 　　4. 双抗（青霉素、链霉素） 　　5. 胰蛋白酶（0.08%） 　　6. 1NHCl 7. 7.4%NaHCO3 　　8. DMSO（剖析纯）或无色新鲜甘油

二、操作过程

（一）细胞冻存

1. 制造含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培育液；

2. 取对数成长期的细胞，用胰蛋白酶把单层成长的细胞消化下来，悬浮成长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中、；

3. 离心1000rpm，5min；

4. 去掉胰蛋白酶及旧的培育液，参加适当制造好的冻存培育液，用吸管悄悄吹打使细胞均匀，计数，调理冻存液中细胞的终密度为5×106/ml～1×107/ml；

5. 将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5 ml；

6. 在冻存管上标明细胞的称号，冻存时间及操作者；

7. 冻存：规范的冻存程序为降温速率-1～-2℃/ min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/ 　　min；到-100℃时，则可敏捷浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h ，然后放入-70℃冰箱中**，取出

冻存管，移入液氮容器内。

（二） 细胞复苏

1. 从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快消融。

2. 从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培育液，混匀；

3. 离心， 1000rpm，5min；

4. 弃去上清液，参加含10%小牛血清培育液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培育瓶，37℃培育箱静置培育；

5. 次日更换一次培育液，持续培育。

三、注意事项

1．从增殖期到构成细密的单层细胞曾经的培育细胞都可以用于冻存，但好为对数成长期细胞。在冻存前**好换一次培育液；

2．将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护作业，避免**；

3．冻存和复苏好用新制造的培育液。