THP-1基因敲除细胞系 ——免疫与炎症研究的利器
THP-1细胞系是从一名患有急性单核细胞白血病的1岁小男孩的外周血中分离得到的[1]，自1980年建系以来，THP-1细胞被广泛用于单核细胞和巨噬细胞相关的机制、信号通路以及营养和药物运输等研究中。相对于U937、HL-60、ML-2等白血病细胞系，THP-1更有类似人原代单核细胞的形态和功能特征（包括细胞分化标记）。相对于人外周血单核细胞（PBMC），THP-1更易在实验室中培养和扩增，且具有更稳定的基因背景，不存在PBMC的个体差异性问题，利于实验结果的重现[2]。因此， THP-1是各大实验室常用的急性单核细胞白血病细胞系，是研究免疫和炎症的理想工具。THP-1 的应用——巨噬细胞分化与炎症模型THP-1与人原代单核细胞都可以被诱导分化为巨噬细胞M1和M2，并释放相应的细胞因子。· 巨噬细胞M1极化：THP-1可被佛波酯(PMA)诱导分化为巨噬细胞，并且可再通过脂多糖(LPS)和IFN-γ诱导M1极化，释放出TNF-α、IL-6等细胞因子，这是典型的炎症模型。· 巨噬细胞M2极化：通过 IL-4 、IL-13和巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）诱导可实现M2极化，分泌TGF-β、IL-10等抑制性细胞因子，这与炎症后期的组织修复和重建的过程类似。· 粥样硬化慢性炎症模型：在氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）的作用下，巨噬细胞可进一步形成泡沫细胞，这是动脉粥样硬化斑块内出现的特征性病理细胞，是一种慢性炎症模型。THP-1 与CRISPR/Cas9技术相结合，有助于免疫和炎症的疾病研究THP-1是一种近四倍体的悬浮细胞，常规的基因编辑方法在THP-1中阳性率很低。由于CRISPR/Cas9易于构建、效率较高和在人细胞中的毒性较低，在基因编辑应用中备受青睐。使用CRISPR/Cas9构建THP-1基因敲除模型，发现与巨噬细胞清除病原体的关键基因巨噬细胞的吞噬体酸化是其清除病原体的必需步骤，吞噬体酸化与巨噬细胞的代谢以及营养物质转运息息相关，而代谢物的转运与溶质运载蛋白（SLC）密不可分。研究人员发现SLC家族中的碳酸氢盐转运体SLC4A7是巨噬细胞的吞噬体酸化必需的基因。通过CRISPR/Cas9技术在THP-1细胞敲除SLC4A7，吞噬体的酸化能力降低，从而其胞内的杀菌能力也相应降低。进行野生型SLC4A7回补后，则增强了吞噬体酸度。这表明巨噬细胞中SLC4A7介导的、碳酸氢盐驱动的对细胞质pH的维持和对吞噬体酸化至关重要[3]。CRISPR-U™可以通过核转染法高效地将gRNA和Cas9转入THP-1细胞中，药筛完成后挑选单克隆培养。选择不同的克隆分别进行靶位点扩增及测序验证，筛选出基因敲除的阳性克隆。
使用CRISPR/Cas9与THP-1细胞，构建慢性肉芽肿病(CGD)疾病模型，有助于开发更有效的疾病治疗方法慢性肉芽肿病(CGD)是一种罕见的X连锁的遗传病，由于机体的CYBB基因发生突变或缺失，导致巨噬细胞缺乏烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸 (NADPH)氧化酶，无法产生过氧化氢来有效杀灭入侵的微生物，这通常会导致细菌和真菌等微生物引起的严重反复感染。有研究者利用CRISPR/Cas9技术，在THP-1细胞中进行CYBB基因的敲除和点突变c.90C>G（该点突变曾在一例CGD患者中被发现），成功构建了首个CGD的细胞模型。对比野生型的THP-1细胞，研究者构建的2个KO克隆（#3和#27）和1个点突变克隆（#2，c.90C>G）在经过PMA和LPS诱导后均出现了H₂O₂水平降低，同时IL-1β、TNF-α和IL-6释放量的明显上升，这与CGD疾病中巨噬细胞的表现一致。
随后，研究者通过慢病毒转染的形式进行CYBB回补，则扭转了这个局面。 这种新的CGD细胞模型为疾病研究提供了强有力的工具，将有助于开发更高效的治疗方法，从而改善患者的生活质量CRISPR-U™可以通过核转染法高效地将CRISPR/Cas9以及ssODN共转入THP-1细胞中，药筛完成后挑选单克隆培养。选择不同的克隆分别进行靶位点扩增及测序验证，筛选出点突变的阳性克隆。通过建立基因敲除和敲入的THP-1细胞模型，明确胞内抗病毒反应的信号通路DNA通常定位于细胞核中，而异常定位在胞浆中的DNA与通常与病毒感染或肿瘤发生有关。cGAS-cGAMP-STING信号通路可检测胞浆dsDNA的存在，并诱导强效的免疫反应，产生干扰素和激活其他免疫应答基因。与之对应的，RIG1-MAVS可以检测胞浆内的pppRNA（一类dsRNA，某些病毒的基因组），并诱导免疫应答。有时候胞浆内会出现RNA和DNA的杂交复合物，这种分子通常在某些病毒感染的情况下出现。为了研究这种RNA-DNA复合物是通过哪个通路激活免疫应答，研究者分别构建了MAVS、cGAS、STING敲除的THP-1细胞，分别将dsDNA、pppRNA、RNA-DNA复合物导入细胞，发现RNA-DNA复合物是通过cGAS-cGAMP-STING通路进行免疫激活。
随后，研究者通过CRISPR/Cas9技术将2A-GLuc敲入到IFIT1基因座，使其受IFIT1的启动子驱动表达，IFIT1是一个典型的干扰素激活表达的基因。后续实验显示，导入RNA-DNA复合物后，由于干扰素的表达，激活了IFIT1启动子驱动GLuc的表达。这些结果进一步证明了胞浆的RNA-DNA复合物是通过cGAS-cGAMP-STING信号通路激活免疫反应，为抗病毒研究提供了思路[5]。CRISPR-U™可以通过使用通过核转染法高效地将gRNA、Cas9和Donor共转入THP-1细胞中，进行药筛，药筛完成后挑选单克隆培养。选择不同的克隆分别进行靶位点扩增及测序，筛选出敲入纯合的阳性克隆。
参考文献：[1] Tsuchiya S, Yamabe M, Yamaguchi Y, et al. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP‐1)[J]. International journal of cancer, 1980, 26(2): 171-176.[2] Chanput W, Mes J J, Wichers H J. THP-1 cell line: an in vitro cell model for immune modulation approach[J]. International immunopharmacology, 2014, 23(1): 37-45.[3] Sedlyarov V, Eichner R, Girardi E, et al. The bicarbonate transporter SLC4A7 plays a key role in macrophage phagosome acidification[J]. Cell host & microbe, 2018, 23(6): 766-774. e5.[4] Benyoucef A, Marchitto L, Touzot F. CRISPR gene-engineered CYBBko THP-1 cell lines highlight the crucial role of NADPH-induced reactive oxygen species for regulating inflammasome activation[J]. Journal of Allergy and Clinical Immunology, 2020.[5] Mankan A K, Schmidt T, Chauhan D, et al. Cytosolic RNA: DNA hybrids activate the cGAS–STING axis[J]. The EMBO journal, 2014, 33(24): 2937-2946.