上游技术 | 乳酸累积如何“破”？详解CHO中乳酸消耗的驱动机制和调控策略
在基于CHO细胞培养的上游生产工艺中，乳酸代谢转变非常重要，即：从乳酸生成到消耗的转变。一般而言，能够正常实现乳酸代谢转换的细胞通常具有良好的生长能力和较高产率，因此工艺开发中会尽可能地促成这种转换。不过，其背后的机制尚未明确。本综述旨在全面总结乳酸代谢转换相关的理论，并寻求高效的乳酸代谢调控策略。
文章主要探讨了pH、NAD+/NADH、丙酮酸利用率、线粒体功能等因素对乳酸代谢的影响，提出了一个基于细胞氧化还原状态的假说来解释乳酸代谢转换的驱动机制。最后，还介绍了各种调控乳酸代谢的技术，包括培养环境控制、基因工程改造和细胞系筛选系统优化等。
1、乳酸代谢转换的分子机制
（1）MCT对乳酸代谢的作用及其工作原理；
（2）LDH同工酶及其表达和翻译后修饰对乳酸代谢的影响；
（3）乳酸与丙酮酸代谢的相互作用；
（4）氧化还原平衡对乳酸代谢的影响；
（5）线粒体活性对乳酸代谢的作用。
2、调控乳酸代谢转换的策略
（1）通过代谢工程改造法减少乳酸生成和促进乳酸消耗；
（2）通过优化培养基和工艺控制策略调控乳酸代谢；
（3）筛选乳酸代谢转换能力强的细胞株。
生产中所使用CHO细胞中，大多数具有很强的糖酵解功能（图1），在培养初期所消耗的葡萄糖中约75%用于生成乳酸。
图1 乳酸相关代谢途径
根据历史经验，乳酸浓度低于20 mM尚可接受，高于40 mM则会对细胞生长和产率造成不利影响。累积的乳酸不仅会抑制细胞生长，而且会导致pH下降，从而需添加碱液，进一步使渗透压升高，最终导致细胞培养环境恶化。因此，一般认为乳酸代谢转换是比较理想的代谢特征，即细胞可从乳酸生成途径转换至乳酸消耗途径。乳酸被及时消耗可以防止培养基酸化，使得pH更稳定。所以，碱液需求量减少，渗透压能维持在较低水平，从而可添加更多营养物以满足需求。此外，大量研究表明，乳酸代谢转换与高产率之间存在较强的相关性。不过，虽然乳酸代谢转换在CHO细胞培养中较常见，但其发生机制仍不清楚（表 1）。
表1 乳酸代谢转换相关研究的总结
因此，本综述旨在总结相关研究结果，从分子水平上剖析驱动乳酸代谢转换的原因，并且归纳调控乳酸代谢的策略。
乳酸消耗途径涉及两种关键蛋白质：一种是单羧酸转运蛋白（MCT），乳酸和H+通过该蛋白共转运出入细胞；另一种是乳酸脱氢酶（LDH），将乳酸转化为丙酮酸，使其进入中枢代谢途径。调控好这两种蛋白中的任何一种，都有可能促成乳酸代谢转换。
MCT
胞内MCT的调控主要发生在表达水平，受到刺激可使其表达水平发生改变。研究表明，MCT1是CHO细胞中一种主要的MCT，AMP活化蛋白激酶（AMPK）和受过氧化物酶体增长因子激活的受体γ辅激活因子1α（PGC1α）都参与其转录控制。
MCT一旦被表达出来，其活性完全由穿过细胞膜的乳酸和H+的相对浓度控制，这一特性可以解释培养环境中细胞外乳酸浓度的变化规律（图2）。最初，细胞外的乳酸浓度较低，因此细胞产生的任何乳酸都会被输出胞外。由于糖酵解反应，细胞溶质被酸化，从而在质膜上形成pH梯度，这也会驱使乳酸向胞外运输，最终导致胞外环境中乳酸积累。不过，由于其能使细胞质去酸化，故对细胞更有利。因此，乳酸在培养也中达到很高的浓度，主要由培养液中的pH缓冲体系所致。向培养基中添加碱会提高胞外的pH值，从而维持质膜的pH梯度，使MCT能够持续输出乳酸。若要使细胞消耗乳酸，必须出现以下两种情况之一：1、细胞内H+的浓度必须下降，质子沿着其浓度梯度流入，乳酸便会随H+一起运输至胞内（图2d）。2、或者胞内乳酸的浓度必须低于胞外乳酸浓度，直至其能够克服pH梯度向胞内运输（图2c）。如果质子在细胞反应中被利用或其生成量减少（例如：糖酵解通量减少），或者乳酸被LDH氧化，则可能发生第一种情况。乳酸氧化会降低其在细胞质内的浓度，从而促使乳酸流入细胞。因此，乳酸盐的消耗需要能逆转质膜上的H+和乳酸盐梯度。
图2 乳酸和pH对MCT的影响
LDH同工酶及其表达和修饰
乳酸要重新进入代谢并被消耗，必须通过LDH氧化为丙酮酸。这意味着，可以通过调控LDH来控制丙酮酸和乳酸间的转变。
通常，在培养过程中LDH活性会发生变化。LDH有三种同工酶：LDHA、LDHB和LDHC。其中，LDHC具有生殖细胞特异性，形成同源四聚体。然而，如果LDHA和LDHB也在同一细胞中表达，则会形成异四聚体。LDHA基因编码LDH-M亚基，而LDHB编码LDH-H亚基。由于LDH是四聚体，所以可以形成5种不同的异构体，这取决于LDH-M和LDH-H肽的组装比率。由于LDH-M和LDH-H对丙酮酸和乳酸的亲和力不同，因此这些同工酶的动力学性质也有所不同。LDH-M对丙酮酸具有较高的亲和力，因此优先催化正向反应，而LDH-H对乳酸具有较高的亲和力，因此易于催化反向反应（图3）。
图3 LDH同工酶
由于每种同工酶的动力学特性差异，乳酸生成和消耗速率受每种异构体的相对丰度控制。基于此，乳酸代谢转换可能与LDHB表达量增加有关。LDHB具有更多LDH-H，因此优先催化反向反应，生成丙酮酸。LDH基因的表达谱在衰老、细胞转化、缺氧和CHO细胞培养过程中会发生变化。其中，培养过程中降温后LDH-C的表达量会明显增加，从而开启乳酸消耗模式。
不过，总体而言LDH是一种稳定的高表达酶，具有较高的比活性，因此可能会在细胞内达到接近动态平衡的状态。一般认为，同工酶的动力学特性并不会影响平衡常数（Keq），因此各种LDH同工酶的比例变化不会影响乳酸积累。这是因为，如果Keq相同，产物与反应物的比率也会保持不变。但是，在出现干扰的情况下，细胞内的同工酶的形式和比例会影响反应再次达到平衡的速度。此外，即使反应接近动态平衡，细胞环境也并非封闭系统，会有很多干扰因素，例如：乳酸和丙酮酸可出入细胞，而其它代谢反应也会消耗或生成丙酮酸、NAD+和NADH。在生物反应器中的细胞培养是一个动态培养环境，所以同工酶种类和比例也会随时间推移而发生变化，从而在一定程度上控制乳酸从生成到消耗的转变。需要进一步研究确认CHO细胞中表达哪些LDH基因，并在生产过程中跟踪其表达种类和表达量，以探究LDH基因表达对乳酸代谢转换的影响。
LDH的表达水平受到多种因素的调控，包括：转录因子或表观遗传修饰的调节作用、翻译后修饰、降解控制等。例如，BCL2可显著降低LDHA的转录水平；沉默AMPK可以上调LDH的表达水平；铜离子可以影响LDHA的转录水平。许多癌症相关蛋白（如：c-Myc、KLF4、FOXM1、EGFR和HIF1）以及其它因素（如：cAMP、雌激素甚至乳酸本身）均可调节LDHA的表达水平。而且，由于LDH在氧化还原稳态中而起到重要作用，所以其还可能受到更为复杂而严格的调控。此外，LDH基因的甲基化也可控制其转录水平，启动子高度甲基化会抑制LDHB表达。
翻译后修饰方面，磷酸化作用可提高LDH亚基的四聚体组装效率和增强其对NADH的亲和力，而乙酰化则会抑制LDH活性并促进其降解。因此，CHO细胞中LDH翻译后修饰状态的短暂变化也可能改变乳酸的生成速率。
乳酸和丙酮酸
尽管细胞有能力调控LDH，但其接近平衡状态，这就意味着LDH代谢通量的主要驱动因素是其底物的相对浓度。通常，细胞质中的NAD+/NADH比率为∼700:1，而乳酸/丙酮酸比率为∼20:1。若丙酮酸或NADH水平升高，则有利于正向反应；若乳酸或NAD+水平升高，则有利于反向反应。通常产物/反应物比率的变化会使平衡点发生偏移，从而驱动LDH反应的逆转以消耗乳酸。如此看来，乳酸本身也是乳酸代谢转换的驱动因素之一。而且，由于乳酸仅限于这一代谢反应，其自身浓度几乎完全取决于丙酮酸、NAD+和NADH的相对浓度。因此，即使乳酸浓度是代谢转换的驱动因素，也必须先改变丙酮酸、NAD+或NADH的相对浓度。与乳酸不同的是，丙酮酸可以参与多种代谢途径，这意味着丙酮酸的浓度会受多种因素影响。当丙酮酸被LDH以外的酶代谢时，胞内丙酮酸存量（丙酮酸池）可能会被耗尽。为了补充丙酮酸，胞内LDH会催化反向反应消耗乳酸，这意味着可以通过调控其它丙酮酸消耗反应途径来促进乳酸代谢转换。例如，丙酮酸脱氢酶激酶（PDK）对丙酮酸脱氢酶（Pyruvate dehydrogenase，PDH）的磷酸化导致其失活。在CHO细胞培养的早期阶段，PDH可能因磷酸化而失去活性，导致丙酮酸积累，从而促进乳酸生成。如果随后丙酮酸脱氢酶磷酸酶使PDH去磷酸化，则丙酮酸池可被线粒体消耗。随后，细胞质丙酮酸减少，进而触发LDH反应逆转，通过乳酸消耗代谢途径回补丙酮酸。同样，丙酮酸羧化酶（PYC）和苹果酸酶（苹果酸脱氢酶脱羧酶）将丙酮酸供给TCA循环，从而消耗丙酮酸池。
糖酵解通量控制
胞内丙酮酸浓度也受其产生速率影响，即糖酵解速率。若丙酮酸生成量超过消耗量，则高糖酵解通量会可导致丙酮酸累积。例如：流加培养早期，糖酵解通量高，所以丙酮酸的生成量很高，因此会导致乳酸累积。反之，糖酵解通量下降会导致丙酮酸池被消耗，细胞便会通过消耗乳酸来回补丙酮酸池。糖酵解通量调节节点已研究得较为透彻，其调节酶包括：己糖激酶（Hexokinase，HK）、磷酸果糖激酶（Phosphofructokinase，PFK）和丙酮酸激酶（Pyruvate kinase，PK）。这些酶常会受到反馈抑制，例如：ATP、低pH值和乳酸皆可抑制PFK，而6-磷酸葡萄糖会抑制HK。
因此，可通过糖酵解通量调控丙酮酸转化为乳酸的通量。理论上，在高糖条件下，通过糖酵解酶的代谢通量很高，胞内会形成丙酮酸池，进而生成乳酸。反之，当葡萄糖水平下降时，糖酵解酶在细胞质中更为分散，丙酮酸可自由进入线粒体。通过这种方式，可以控制糖酵解通量和LDH可用的丙酮酸池，故有望通过该途径驱动乳酸代谢转换。
一般而言，高糖酵解通量与细胞快速分裂有关，随着细胞生长减缓而减少。葡萄糖转运蛋白1（Glucose transporter 1，GLUT1）负责将葡萄糖转运至胞内，因此可通过降低GLUT1表达水平来限制葡萄糖摄取量和糖酵解通量，从而间接驱动乳酸代谢转换。除葡萄糖外，其它能进入糖酵解途径的营养物也会影响该途径的总通量。例如：葡萄糖耗尽后细胞会转而消耗乳酸；营养输入不足所导致的糖酵解通量减少会使细胞消耗丙酮酸和NADH，进而促进乳酸消耗。通过这种方式，当细胞无法再从培养基中获取碳源时便可通过消耗乳酸进行补充。
不过，研究表明，即使存在过量的葡萄糖，也能实现乳酸代谢转换。例如：另一主要碳源谷氨酰胺也可以转化为α-酮戊二酸而进入TCA循环，再生成苹果酸。然后，苹果酸被苹果酸酶（去羧苹果酸脱氢酶）氧化成丙酮酸以回补丙酮酸池。因此，谷氨酰胺耗竭也会使丙酮酸池减少，进而驱动乳酸代谢转换。
虽然上述营养耗竭的情况下均可实现乳酸代谢转换，但去无法解释营养充足的培养过程中乳酸的代谢转换现象。
氧化还原平衡
由于NAD+和NADH也是LDH的底物（图4），故细胞质的氧化还原状态是决定反应方向的重要因素。如果NADH水平升高（例如：当糖酵解通量较高时），LDH将丙酮酸还原为乳酸以实现NAD+再生。该反应是可逆的，因此LDH可用于维持氧化还原平衡。通过这种方式，细胞的氧化还原状态可以与乳酸和丙酮酸的相对浓度联系起来，这意味着可通过氧化还原电位的变化驱动乳酸消耗。此理论也可用于解释前述糖酵解通量与乳酸之间的关系，高糖酵解通量导致NADH大量产生，细胞需要通过生成乳酸来补充NAD+。糖酵解通量减少后，NADH代谢存量减少，从而会改变NAD+/NADH比率，需要通过消耗乳酸使其恢复平衡。
图4 LDH催化的酶反应
氧化还原电位是生化反应的重要驱动因素之一，其平衡发生紊乱会对细胞生理状态造成不利影响，还可能损伤蛋白质、脂质等大分子物质。按照上述理论，细胞可通过LDH消耗乳酸，进而调控氧化还原平衡，这能很好地解释乳酸消耗对工艺表现的改善作用。相反，不能消耗乳酸的细胞更难维持其氧化还原状态，从而会导致细胞生长速率和产量降低。
线粒体活性
糖酵解和TCA循环之间的平衡关系对细胞氧化还原状态有非常重要的影响作用，这表明乳酸代谢转换很可能与线粒体功能有关。NADH在糖酵解过程中产生，并被线粒体中的电子传递链（Electron transport ch，ETC）消耗。如果糖酵解不能满足线粒体的NADH需求，细胞则可以通过消耗乳酸来提供NADH，从而维持ETC的平衡。因此，糖酵解减少或线粒体活性上调都可能驱动乳酸消耗。
有研究表明，缺乏铜离子会抑制乳酸代谢转换，通过上述糖酵解和线粒体功能之间的平衡也可以解释这一现象。铜是ETC复合物IV中一个重要辅因子，这意味着缺乏铜会损害ETC，从而减少了细胞对NADH的需求，进而导致NADH增加，故并不需要消耗乳酸。
通过这种机制，可以通过增强线粒体功能来减少丙酮酸和NADH的代谢池，从而打破糖酵解与氧化磷酸化之间的平衡。
代谢工程改造
常用的一种改善细胞代谢的方法是对胞内代谢途径进行基因工程改造，CHO细胞基因组测序和基因组尺度的代谢模型等技术的高度发展使得合理定位新的酶和代谢途径成为可能。对于乳酸积累问题，基因工程改造一般主要聚焦于丙酮酸代谢相关的途径。
由于乳酸是通过LDH催化的单一反应产生和消耗的，因此在设计减少乳酸生产的基因工程改造时，首当其冲是敲除或下调LDH。一般而言， 敲除LDH可减少葡萄糖消耗和乳酸生成，而不会损害细胞生长、活率和产率。不过，减少乳酸生成量会阻碍NADH在细胞中再生成NAD+，因此糖酵解通量可能受限。丙酮酸是乳酸的主要来源，故也可通过代谢工程方法将丙酮酸转移至其它途径来减少乳酸生成。例如，过量表达丙酮酸羧化酶（Pyruvate carboxylase，PYC）可将丙酮酸转化为草酰乙酸，然后再还原为苹果酸，在此过程中形成NAD+。苹果酸通过苹果酸-天冬氨酸穿梭运输到线粒体后被再氧化成草酰乙酸，形成NADH。采用此方法可通过消耗乳酸来增加TCA通量，减少胞内的丙酮酸代谢池。
此外，也可通过改变其它酶的表达水平来消耗丙酮酸和减少乳酸生成。敲除PDK可以提高PDH活性，从而使更多丙酮酸变成乙酰辅酶A进入TCA循环，最终减少乳酸生成。
苹果酸脱氢酶2（Malate dehydrogenase 2，MDH2）是TCA循环的限速酶，过量表达MDH2可以增加线粒体中的草酰乙酸，从而提高柠檬酸合成酶的活性，最终使更多丙酮酸进入TCA循环。此外，该反应也产生NADH，因而可以维持对线粒体更有利的氧化还原状态。
果糖转运体GLUT5对果糖的亲和力低于葡萄糖转运体GLUT1对葡萄糖的亲和力。表达GLUT5，用果糖替代葡萄糖，可以通过降低糖酵解通量来减少乳酸的积累。通常，CHO细胞在含有果糖但不含葡萄糖的培养基中不能存活；这是由于GLUT5缺失或表达量低。采用基因工程改造提高GLUT5表达量后，细胞可在以果糖替代葡萄糖的培养基中正常生长，而且乳酸生成量少，代谢效率更高。使用时间敏感启动子在后期培养阶段启动GLUT5表达，从而实现两阶段代谢，即：在早期培养阶段通过葡萄糖刺激细胞生长，随后细胞转而利用更有利于代谢平衡的果糖。
通过基因工程方法提高细胞的抗凋亡能力，也可改善乳酸代谢，例如：过量表达抗凋亡基因BCL-2Δ的细胞在早期阶段的乳酸生成速率较慢，而后期乳酸消耗速率却更高。总之，抗凋亡细胞会让更多的丙酮酸进入线粒体，而非生成乳酸，且其并不似非抗凋亡细胞那样强烈地依赖乳酸生成来维持氧化还原平衡。
最后，进行代谢工程研究时，必须考虑CHO细胞的异质性。克隆差异性对生长、代谢效率和产率有很大影响，仅测试单一克隆并不足以得出普适性结论，应采用混合克隆或一组单细胞群体进行评估。
培养基和工艺控制策略优化
相比于改造细胞，改变培养基组分和其它控制条件（如：pH、温度等）等细胞外环境来改变代谢的犯法更为简单快捷。
细胞对葡萄糖的吸收和代谢速率较快，通常会导致低效代谢和乳酸积累。如果使用另一种吸收或代谢较慢的糖，则可减少糖酵解通量，从而缓解乳酸积累问题。据研究，半乳糖、果糖、甘露糖和麦芽糖均可作为替代能源。
另外，除上述采用替代糖源的方法外，将培养环境中葡萄糖浓度维持在较低水平也可降低糖酵解通量和减少乳酸生成。尽管这种“饥饿疗法”可减少乳酸积累，但其会对产品质量产生不利影响，即使在短时间内缺乏葡萄糖也会影响产物的糖基化修饰。
使用pH控制培养基中剩余葡萄糖，可以提高葡萄糖的代谢效率。pH值升高表明细胞在消耗乳酸，因为质子通过MCT共同运输到细胞中。乳酸消耗意味着葡萄糖浓度较低，因此可在pH值升高至设定点以上时向生物反应器补充葡萄糖。然后，乳酸生成量会再度增加，使pH值下降，从而阻止继续流加葡萄糖。
近年来，随着在线自动取样、实时监测代谢产物等技术的发展，可直接监测过程中的葡萄糖和乳酸浓度，从而实时控制流加策略以防止代谢溢出。例如：可使用拉曼光谱检测葡萄糖和乳酸水平，仅葡萄糖和乳酸浓度低于其设定值时才开始流加葡萄糖，如此可有效防止乳酸积累。技术进步也使得多尺度组学分析成为可能，例如：可用代谢组学分析法识别CHO流加培养过程中可能累积的抑制性代谢物，并据此合理设计培养基以防止抑制性化合物积累。
向培养基中添加化学添加物也可改善乳酸代谢，而且其风险很小。例如：如前所述，细胞缺乏铜可能导致ETC功能紊乱，使得细胞更多地通过糖酵解生成乳酸。因此，可通过添加铜离子或者优化其它培养基组分改变线粒体活性和糖酵解通量之间的平衡，进而驱动乳酸代谢转换。
通过添加碱或酸可以改变培养基的pH值。已有研究证明，降低培养系统的pH值可促进乳酸代谢转换。此外，可以将pH值控制与温度控制相结合，低温能降低细胞的整体代谢活动，从而减少葡萄糖摄取和乳酸生成。
细胞株筛选
在许多研究中，不同细胞在相同条件下乳酸生成和消耗方面表现可能不一样。这表明，细胞乳酸代谢在某种程度上是预先确定的。因此，可以优化细胞筛选过程，以选择具良好代谢表型的克隆。例如：使用罗丹明123根据线粒体膜电位对乳酸生成量较高的克隆进行染色和分类，从中挑选膜电位较低的细胞加以筛选，则可筛选出乳酸生成率很低且生长速度更快的亚克隆。还有一些研究发现，线粒体膜功能与乳酸生成率之间有一定关联性，所以将线粒体氧化能力作为细胞筛选标记。此外，线粒体体积大的细胞的TCA循环能力更强，更有利于乳酸代谢转换，故也可以之为细胞筛选标记。
运用上述方法可以快速锁定目标细胞群，以较少工作量筛选到具有理想代谢特征的细胞，从而可减少材料和劳动力成本。然而，即使是来自同一克隆的细胞，其葡萄糖摄取速率和乳酸生成速率方面也可能有很大差异，因此建议开展两轮代谢筛选，一轮用于宿主细胞，另一轮在克隆筛选后开展。
如上所述，有很多策略可以用于调控乳酸代谢转换。从技术和监管的角度来看，化学添加物等方法相对容易开展，而细胞系筛选过程优化或代谢工程改造更为困难。
由于CHO细胞基因组的不稳定性和转录组的易变性，其具有较高的多样性。因此，若采用的细胞不同，即使在相同的条件下也可能获得不同的结果。而且，培养基、培养容器、培养规模等都可能影响实验结果。所以，需要审慎地看待各种结果，并进行适当的通用型研究。此外，即使是理想的细胞株，其特性在生产过程中也可能发生变化。例如：培养早期需要细胞有较高的生长速率以所需的高细胞密度，旨在提高体积产量。后期，与高比生产速率相关的代谢平衡则是首要选择。因此，未来可能会更多地选择二阶段培养法，不同时间采用不同的培养基。另外，引入一些可诱导的基因开关，从而在不同的阶段均可通过诱导获得理想的细胞特性。
全面深入地理解乳酸代谢转换的根本原因有助于制定更具针对性的调控策略，更深入地理解驱动乳酸代谢转换的分子基础有助于更好地运用这些策略和提高其通用性。
目前，CHO细胞基因组已于2011年公开，一些仓鼠微阵列方法也已开发完善，这些工具在识别乳酸代谢转换的潜在标志物方面具有很大的潜力。除了CHO细胞，采用其它细胞开展的乳酸代谢机理方面的研究也有了一些新突破。例如：采用脑组织和肿瘤细胞研究发现，细胞中还存在反向沃伯格效应（Reverse Warburg Effect），即一种细胞生成乳酸并提供给另一种细胞消耗的乳酸穿梭途径。对这些系统进行深入研究，有助于进一步阐明CHO细胞中的乳酸代谢转换现象，例如：可以对Reverse Warburg Effect中的乳酸生成细胞和乳酸消耗细胞进行蛋白质组学/转录组学分析比较。
本文在乳酸代谢转换的机理及其与高产率之间的关系有一些特别的见解。首先，毫无疑问乳酸消耗期间氧化代谢产生的ATP能够满足蛋白质合成的能量需求。如本综述所述，乳酸消耗也可能使细胞能更好地维持氧化还原平衡，从而可改善整体细胞生理状态和提高产量。据此，本文提出一个解释乳酸代谢转换机制的假说，即：根据LDH催化反应的性质，乳酸的产生和消耗可用于维持胞内氧化还原态。因此，胞内乳酸代谢转换可能是由NAD+/NADH比率扰动所触发的，消耗乳酸的目的是恢复胞内氧化还原平衡。而且，NAD+/NADH比率可直接或间接地受到其它几种乳酸转换触发因素的影响，这意味着大部分情况下乳酸代谢转换都是受氧化还原状态变化所驱动的。
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撰文 | 细胞牧人HD
修审 | 细胞牧人HD
编辑 | 细胞牧人HD
校稿 | 细胞牧人HD