ISME：多组学揭示低氧环境下的汞甲基化细菌

代谢多样的世界性海洋细菌对汞的甲基化作用

Mercury methylation by metabolically versatile and cosmopolitan marine bacteria

The ISME Journal [IF:9.180]

DOI: https://doi.org/10.1038/s41396-020-00889-4

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41396-020-00889-4

发表日期：2021-01-27

第一作者：Heyu Lin（林禾雨）¹

通讯作者：John W. Moreau([e-mail])^1,11

合作作者：David B. Ascher, Yoochan Myung, Carl H. Lamborg,Steven J. Hallam,Caitlin M. Gionfriddo,Kathryn E. Holt

主要单位：

¹墨尔本大学地球科学学院(School of Earth Sciences, The University of Melbourne, Parkville, VIC 3010, Australia)

¹¹目前在格拉斯哥大学地理与地球科学学院(Present address: Currently at School of Geographical & Earth Sciences, University of Glasgow, Glasgow G12 8QQ, UK)

摘要

甲基汞(MeHg)是一种能够在陆地和海洋食物网中积累的神经毒素，对人类健康有潜在影响。甲基汞由微生物介导从二价汞转化而来，这个过程需要hgcAB基因簇的参与。汞的甲基化过程长久以来被认为是在厌氧环境中进行的，然而最近有研究表明甲基汞也可能在低氧的海水中形成。不过我们对低氧环境中能够转化汞的微生物知之甚少。在本研究中，我们对加拿大萨尼奇湾(Saanich Inlet)的氧化还原梯度海水样品进行了大规模的多组学分析，并测量了汞和甲基汞的浓度剖面数据。我们发现了几个潜在的汞甲基化微生物类群，包括Calditrichaeota门细菌、 SAR324类群细菌和Marinimicrobia门细菌。其中Marinimicrobia是丰度最高且最活跃的甲基化细菌。我们还利用蛋白质同源建模技术构建了Marinimicrobia中HgcAB蛋白的三维模型，推测其具有功能性汞甲基化蛋白必备的氨基酸保守位点、氢键位置和必要的折叠结构。此外，本研究中发现的几个新型汞甲基化细菌的基因组中还带有多个呼吸链末端氧化酶。我们的研究揭示了一些潜在的新型海洋汞甲基化微生物，它们拓宽了我们对于汞甲基化微生物耐氧性和分布范围的认识。

背景

汞(Hg)是一种有生物毒性的重金属，其主要来源于人类的生产活动，也在自然活动如火山喷发中释放。在过去的几十年里，汞污染曾经导致过很多公共卫生事件，如著名的日本水俣病事件。因此我们需要对汞循环的机制有更多了解。另外，全球气候变化导致的海洋水体含氧量变化可能会导致全球生物地球化学循环的变化，这其中我们对于碳、氮、硫等元素的循环了解较多，但对于汞循环，我们还有很多不了解的方面。

由二价汞Hg(II)到甲基汞的转化是一个微生物介导的过程，这个过程需要一个双基因簇hgcA和hgcB来参与。以前的研究表明拥有hgcAB基因对的细菌都具有汞甲基化的功能。到目前为止，所有经实验验证的汞甲基化微生物全部是厌氧菌。它们来自于δ-变形菌，厚壁菌门(Firmicutes)，和一个古菌类群甲烷微菌纲Methanomicrobia。这些微生物在土壤、沉积物、海水、淡水，多种极端环境、甚至是动物肠道中广泛存在。近些年，通过一些非培养的方式也另外发现了一些汞甲基化细菌，如Chloroflexi, Chrysiogenetes, Spirochaetes, Nitrospina(也由本实验室报道), 和Verrucomicrobia。

除了汞的甲基化过程，甲基汞的去甲基化过程在全球汞循环中也扮演了重要地位，其主要由merB基因表达的烷基汞裂解酶(alkylmercury lyase)催化。merB基因广泛存在于好氧菌中，如芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌，然而某些专性和兼性厌氧菌(如一些地杆菌)中也发现存在merB基因，因而他们也在调节总甲基汞含量中起到作用。

曾有文献报道过甲基汞在中上层海洋的微氧环境或氧梯度环境中有富集现象。在这些环境中，氧气浓度的变化可能导致生物代谢的电子受体发生改变，因此导致其耦连的C, N, S, Fe和 Mn等元素循环发生变化。最近有一些其他报道也指向海冰或海水中微氧环境下的汞甲基化发生。

本研究测量了加拿大温哥华岛近岸的一个季节性厌氧峡湾——萨尼奇湾(Saanich Inlet)海水中的总汞(total Hg)和甲基汞浓度，并获取了不同水层的宏基因组、宏转录组数据。萨尼奇湾是一个研究氧梯度的模型生态环境，为我们研究低氧环境中微生物介导的汞循环以及寻找新型的汞甲基化微生物提供了理想场所。我们还对本研究中新发现的HgcAB蛋白进行了同源建模来预测其功能性。最后，我们在全球的宏基因组数据库中搜索我们发现的新型HgcA蛋白，来评估这种蛋白在全球各种环境的分布以及其潜在的汞甲基化对环境的影响。

结果与讨论

萨尼奇湾海水的汞与甲基汞含量

Hg and MeHg concentrations along redox gradients in Saanich Inlet

图一所示萨尼奇湾海水S3站位(图1A)从10 m至200 m间8个不同深度的汞含量。总汞含量在120 m以上都维持在较低的水平，从135 m开始保持增长(图1B)。甲基汞在100 m以上不能被检出，在100 m以下保持增长，直到150 m达到峰值0.50 pM (占总汞的17.2%)，但其在165 m下降到0.1 pM，并在200 m时浓度减小到不可检出(图1C和D)。相似的甲基汞峰在其它海洋环境中也有被报道过，如太平洋、北冰洋、南大洋、阿拉伯海和地中海。

图 1 采样站位与S3站位的汞检测数据

Map of Saanich Inlet and mercury profiles of station “S3”

A 萨尼奇湾地图以三角形显示了站点“S2”，“S3”和“S4”的位置。

B “S3”站的总溶解汞浓度。

C “S3”站的溶解的甲基汞浓度。

D MeHg占“ S3”站总溶解Hg的百分比。

宏基因组分箱与寻找汞甲基化微生物

MAG (metagenome-assembled genome) reconstruction and putative Hg methylator identification

本研究采用微分丰度分箱的方法共得到2088个完整度>70%，污染度<5%的MAGs(metagenome-assembled genome，宏基因组拼装基因组)。其中有来自7个门的56个MAGs带有hgcA基因。这其中来自Marinimicrobia和 Calditrichaeota门的甲基化细菌是首次报道。

15个带有hgcA的MAGs属于Marinimicrobia，其中质量最高的MAG具有97.8%的完整度和0%的污染，75个contigs。其中有一些MAGs还带有16S rRNA基因序列可以验证其分类地位。值得一提的是，在HgcA的进化树(图2)中，Marinimicrobia-HgcA序列与古菌的HgcA序列关系较近，提示这条序列在进化中可能出现水平基因转移。

图 2 HgcA氨基酸序列的系统发育树

Maximum-likelihood phylogenetic tree of HgcA amino acid sequences (1000 ultrafast bootstrap replicates; values >90% are shown by black dots at the nodes)

在这项研究中回收的hgcA序列以蓝色突出显示。从公共数据库检索到的hgcA序列以黑色显示。先前研究中实验确认的hgcA以棕色显示。来自非甲基化细菌的hgcA旁系同源物被用作外群，并以灰色显示。本研究中使用的15个代表性hgcA序列用星号表示。携带hgcA的基因组的分类学分类在外圈用不同的颜色标记。比例尺表示每个站点的替换。

另外有3个带有hgcAB基因的MAGs属于Calditrichaeota门；有8个带有hgcAB基因的MAGs属于变形菌门，且均为δ-变形菌。这些来自δ-变形菌纲的汞甲基化细菌多样性很高，他们在进化树中分为几个不同的分支，其中SAR324分支被首次报道含有hgcA基因。

hgcA基因和转录本的相对丰度

Relative abundance of hgcA genes and transcripts in Saanich Inlet

56条hgcA序列经过99%一致性阈值聚簇，被分为15个组，每组挑出一条代表性序列来研究其丰度。结果显示hgcA基因在萨尼奇海湾中广泛存在，其丰度随着海水深度的增加而升高，在~200 m 达到最高(图3A)。因为hgcA是单拷贝基因，这同时说明了汞甲基化细菌在底层水体富集。值得一提的是，Marinimicrobia是整个水体中丰度最高的汞甲基化类群，其丰度在很多200 m深度的样品中可占有微生物群落的~2%(图3B)。带有hgcA的δ-变形菌也在200 m水体中具有较高丰度。带有hgcA的Nitrospina虽然不是优势类群，但他们的丰度从海水表层到底层相对稳定，这可能是因为他们对氧化还原梯度的适应性较高。

图 3 代表性hgcA基因与其转录本的相对丰度

Relative abundance of representative hgcA genes and transcripts in different samples from Saanich Inlet

通过每个样品的基因长度和基因组当量对基因丰度进行标准化，转录本丰度表示为RPKM值。

A 不同深度的代表性hgcA基因总数的相对丰度。

B 来自不同宏基因组数据集的不同代表性hgcA基因的相对丰度。圆圈越大表示整个微生物群落的比例越高。不同深浅的蓝色代表不同的采样深度。

C 不同深度的代表性hgcA转录本之和的RPKM值。

D 在不同的宏转录组学样本中，不同的代表性hgcA转录本的RPKM值。来自宏蛋白质组样品的hgcA序列以星号表示。

与DNA的相对丰度一致，hgcA的转录本丰度同样随着深度而增高，在200 m处达到最大值(图3C)。丰度最高的hgcA转录本来自于Marinimicrobia(图3D)。我们又将hgcA转录本的丰度用管家基因rpoB和gyrB来做标准化，发现hgcA/rpoB和hgcA/gyrB虽然也随着深度而升高，但升高程度都不明显。考虑到总的hgcA转录本丰度随深度有明显上升，我们认为hgcA转录本丰度上升的理由不是汞甲基化细菌在底部变得更活跃，而是因为它们在底部的数量更多才导致的。这一发现与之前很多报道认为hgcA是组成型表达的结论相一致。另外，我们在表层10 m水深处得到了hgcA的DNA但是没有发现相应的转录本。我们在所有深度都只发现疣微菌门hgcA的DNA但没有发现其转录本。我们在宏蛋白组数据中没有发现Calditrichaeota, 疣微菌门, 螺旋体门, 和厚壁菌门的HgcA蛋白。这可能是因为其丰度太低。这些现象提示我们通过仅仅测量hgcA基因的DNA丰度无法有效估计其转录或表达的量。

merB基因和转录本的相对丰度

Abundance of merB genes and transcripts in Saanich Inlet

因为海水中甲基汞的浓度与去甲基化过程也密切相关，我们同时对负责去甲基化的merB基因也进行了研究。merB基因的相对丰度同样在200 m达到最高，占整个微生物群体基因的~0.6%(图4A)。merB的转录本在宏转录组中同样表现为在200 m水深处达到最高点，但其在表层海水中没有转录本存在(图4B)。我们将hgcA与merB的转录本进行比较，发现在120 m水深以上时，merB的丰度高于hgcA，但在120 m水深以下时被hgcA反超，直到到达200 m底层水体时，merB的转录本再次超过hgcA。merB和hgcA的转录本同样在200 m处达到最大值(图4C)。这为我们在图1D中看到的甲基汞浓度在底层水体中快速降低提供了一个可能的解释。

图 4 merB 的DNA与RNA丰度在萨尼奇海湾水体中随深度的变化

DNA and RNA abundance of merB in Saanich Inlet datasets changing with depth

A Saanich入口宏基因组数据集中的merB基因丰度。通过每个样品的基因长度和基因组当量对百分比丰度进行标准化。线图描绘了merB随深度的平均丰度；阴影区域表示95％的置信区间。

B Saanich入口宏转录组数据集中的merB转录本丰富度，以RPKM值表示。线图描绘了merB随深度的平均RPKM值；阴影区域表示95％的置信区间。

C Saanich 入口宏转录组数据集中hgcA(橙色)和merB(绿色)的RPKM值之间的比较。

携带hgcA的Marinimicrobia的系统发育

Phylogenetic analysis of hgcA-carrying Marinimicrobia

我们将所有的15个携带有hgcA的Marinimicrobia和来自公共数据库的409个Marinimicrobia一起构建依据400个管家基因蛋白串联的系统发育树(图5A)。所有的15个带有hgcA的Marinimicrobia在树中聚为一簇。虽然它们中含有的hgcA基因序列完全一致，但是他们的16S rRNA基因不完全相同，最小只有96%的一致性。这说明本次发现的携带有hgcA的Marinimicrobia可能代表了一个新型的种或属。

图 5 Marinimicrobia门的系统发育与全球分布

Phylogeny and global distribution of phylum Marinimicrobia

A 基于串联管家基因的Marinimicrobia门的最大似然系统树(1000个超快速引导复制；值>90%显示在节点上)。比例尺指示每个站点的替换。共有424个Marinimicrobia基因组被用于建树;没有hgcA基因的Marinimicrobia谱系被折叠以简化表达。

B 携带hgcA的Marinimicrobia在全球各种环境中的分布，以不同的颜色显示；括号中显示了每个环境中BioProject的总数。

Marinimicrobia是一种广泛存在的汞甲基化类群

Marinimicrobia is a widespread potential Hg methylator

Marinimicrobia门是一个未培养但分布广泛的类群，在以前的研究中已经有人发现其在氧化还原梯度层中扮演重要角色。我们在本研究中通过将Marinimicrobia-hgcA在NCBI SRA宏基因组数据库进行比对，发现有58个BioProjects中都能找到能匹配其序列的reads片段。这些样品分布广泛，来源多样。其中包括海洋，土壤，沉积物，淡水，工业废水，植物根系等(图5B)。

Marinimicrobia-HgcA和-HgcB蛋白的同源建模

Homology models of Marinimicrobia-HgcA and -HgcB proteins

因为目前没有可培养的Marinimicrobia供我们研究其汞甲基化能力，我们对其HgcA和HgcB蛋白分别进行了同源建模来推测其功能的完整性。我们用汞甲基化模式菌Desulfovibrio desulfuricans ND132的HgcAB蛋白模型来与我们新发现的Marinimicrobia-HgcAB蛋白模型进行比较。Marinimicrobia-HgcA与ND32-HgcA结构相似，都在N末端含有一个球状结构域，同时在C末端含有5个跨膜螺旋(图6A)。ND132-HgcA中非常保守的cap-helix结构及能够与其配合的半胱氨酸残基都能在Marinimicrobia-HgcA模型中找到。这两个蛋白的球状结构中同样有一个可以容纳配体维生素B12的结合口袋(binding pocket)，它们的大小相似，且其中能够与配体进行结合的氢键网相同。对Marinimicrobia-HgcB蛋白的建模发现其在N端有一个2[4Fe-4S]结合域，这与ND132-HgcB相同。它们也都具备保守的(CX2CX2CX3C)模体。另外Marinimicrobia-HgcB蛋白的C末端具有半胱氨酸尾巴，具有转移电子并结合Hg(II)底物的潜力。这些特点也与ND132-HgcB相同。综上所述，Marinimicrobia-HgcAB蛋白的结构与功能性确定的ND132-HgcAB蛋白结构在三级结构上也非常相似，这进一步支持了其是功能性蛋白的推测。

图 6 Marinimicrobia-HgcA 和 -HgcB蛋白的三维同源模型

Three-dimensional homology models of Marinimicrobia-HgcA and -HgcB proteins

A 全长Marinimicrobia-HgcA模型，相对于细胞膜显示。示出了结合钴胺素的功能结构域的放大图，半胱氨酸和钴之间的离子相互作用由虚线表示。

B Marinimicrobia-HgcA模型的Ramachandran图显示，分别有93.2％，5.9％和0.8％的残基位于有利，允许和离群区域内。显示了主干Phi和Psi(φ和ψ)二面角以及在能量上有利的区域。

C 具有两个[4Fe4S]簇的复合体中的全长Marinimicrobia-HgcB模型。蛋白质和铁之间的相互作用用虚线表示。

D 显示了Marinimicrobia-HgcB模型的Ramachandran图，揭示了94.1％，5.9％和0％的残基分别位于有利区域，允许区域和异常区域内。

潜在汞甲基化细菌的基因组构成及其环境适应策略

Genome composition and adaptation strategies of hgcA-carrying MAGs

我们对含有hgcAB基因的MAGs进行KEGG注释来推测其功能和环境适应策略(图7)。在氧梯度层中生活的汞甲基化细菌应能够抵抗间歇性低水平氧气。我们在这些MAGs中找到了多种末端氧化酶。如经典的细胞色素酶c aa3-type (coxABCD)，还有一些其他的末端氧化酶系统如细胞色素酶c cbb3-type (ccoPQNO)，这种酶被证明对氧气有高亲和性，能够使细菌在有氧或低氧条件下进行氧气呼吸。有些MAGs带有细胞色素酶 bd 复合体(cydAB)，这种类型的氧化酶也曾被证明可以支持细菌在低氧条件下存活。另外还有一些MAGs带有细胞色素酶 o (cyoABCD)，这是一种被报道在氧气充足条件下其作用的末端氧化酶。此外，所有的Marinimicrobia和部分δ-变形菌还含有细胞色素酶 (qoxABCD)，这是一种血红素铜氧化酶，其可以利用泛醇或甲萘醌代替细胞色素 c 在经典呼吸链中的位置。综上，我们本次在氧气梯度层中发现的MAGs拥有多种多样的末端氧化酶系统，能够帮助它们在不同的氧气条件下进行呼吸。

图 7 携带hgca的MAGs的KEGG通路

KEGG pathways of the hgcA-carrying MAGs

MAG的分类学分类在热图的底部用不同的颜色表示。热图左侧用不同的颜色表示路径类别。每个细胞的颜色是指每个途径中涉及的酶的完整性。括号中显示了每个途径中涉及的相应基因。

除此之外，碳水化合物降解的基因也在很多带有hgcAB基因的MAGs中被找到，尤其是在Marinimicrobia, 疣微菌门, 和螺旋体门门中。这些MAGs也呈现了多种N、S循环中的代谢可能性。Marinimicrobia MAGs中含有完整的氮化合物电子转移系统，如羟氨氧化还原酶(hao)，亚硝酸盐氧化还原酶(nxrAB)，硝酸盐还原酶(narGHI)，和联氨脱氢酶(hdh)。δ-变形菌纲MAGs具有S代谢的可能性，其中SAR324含有能够编码二甲硫醚(DMS)脱氢酶一个亚基的ddhA基因。值得一提的是，很多MAGs还具有能够编码硫醌氧化还原酶的sqr基因，能够将硫化氢氧化为单质硫来用作呼吸和解毒。几乎所有的MAGs都含有编码三甲胺甲基转移酶的mttB基因，提示其可能具有厌氧一碳代谢的能力。多数MAGs还具有砷还原基因arsABCDR和一些Cu、Fe运送相关的基因。另外它们大部分还具有鞭毛蛋白，这提示它们可能利用鞭毛来游动，从而在氧气梯度环境中找到更适合自己生存的区位。

我们的研究利用非培养的方式发现了一个以前没有被人们认识的海洋汞甲基化细菌类群Marinimicrobia，其分布广泛且功能多样。在以后的工作中，我们需要进一步通过培养的方式来确定其功能并更深层次地阐释其生活方式和对环境的影响。