肿瘤干细胞临床应用研究进展
目前恶性肿瘤患者5年生存率大幅提高，这与早筛选、早诊断、早治疗以及新型治疗手段的出现密切相关。但也仍有部分患者会发生肿瘤复发或转移，甚至在多次治疗后出现治疗耐药，最终导致治疗失败。既往研究证实这些现象的产生与肿瘤干细胞（cancer stem cells，CSCs）的存在密切相关。CSCs最初是在乳腺癌和白血病中发现，它们是肿瘤组织内的一小部分具有逆分化、自我更新能力的细胞，具有潜在的迁徙和转移细胞特征，且对传统化疗和放疗均耐药。因此，针对难治性癌细胞的后续化疗大多预后较差。此外，研究表明CSCs可以分别从遗传学和表观遗传学途径上通过细胞的内外分子调控CSCs异质性，其中mRNA也发挥重要的调控作用。在乳腺癌研究中显示，mRNA-200c/141通过上调蛋白激酶1，激活β-catenin而调节CSCs异质性，促进肿瘤细胞侵袭，是肿瘤细胞存活及逃逸的重要原因。CSCs通过表观遗传学修饰改变代谢途径和表型特征也是肿瘤细胞侵袭转移及耐药的重要原因。这些特征及其临床意义都表明了研究CSCs的重要性。目前也已开发不少靶向CSCs的治疗手段，但是由于缺乏特异性的靶向生物标志物，治疗效果仍然不理想。本文概述了CSCs在肿瘤发生和发展中的重要作用，以及对临床诊断及预后的影响及其靶向治疗的研究新进展，为进一步探索CSCs潜在治疗靶点提供线索。
CSCs的特征
干细胞是能够自我更新的多能细胞，并具有分化成任何细胞类型的潜力，其主要代表为胚胎干细胞。成体干细胞是器官中存在的少量未分化的干细胞。在正常细胞更新或损伤时，成体干细胞便可增殖分化补充受损细胞。CSCs可由正常干细胞经过基因突变累积，增殖分化能力失去控制而产生。在肿瘤发生过程中常常累积许多突变，而最初的致癌突变可能发生在干细胞中。一项关于急性髓性白血病（acute myeloid leukemia，AML）患者的单细胞测序研究显示，在正常造血干细胞中通常携带有一种或两种突变，并同时存在于AML原始细胞中。且在这些细胞中可出现几种关键的突变组合，激活自我更新程序或使衰老和凋亡程序失活，从而赋予早期祖细胞永久的增殖能力。其中，激活自我更新程序包括在多种肿瘤类型中激活的端粒酶（TERT）启动子和AML中的表观遗传调控因子TAL1启动子。衰老和凋亡程序失活包括肿瘤抑制基因突变，如 Tp53 和CDKN2a.45-47，这些赋予细胞不受控制的增殖和扩增特性。这些突变还可发生在干细胞调控相关基因中，如 IDH1/2、DNMT3a/b 和TET2 等。此外，这些基因突变最终都将通过直接或间接上调转录因子调控肿瘤细胞的生物学特征，包括OCT4、SOX2、KLF4、NANOG和c-MYC等。以上干性相关转录因子的上调，与CSCs干性维持、自我更新、药物抵抗、免疫逃避及侵袭转移等密切相关。
1.2 CSCs表观遗传学特征
染色质是由DNA和组蛋白组成的多聚链，是细胞内基因表达调控的重要机制。在CSCs中，通过调节染色质空间结构可以调控相关基因的表达。目前研究表明，染色质的组装密度与耐药性肿瘤细胞存活有关。有研究显示，染色质可通过H3K27me3和H3K4me3分子调节染色质组装密度，调控基因表达水平，针对这两个靶点的药物联合化疗药物应用可根除不同类型肿瘤细胞。近年也有研究表明上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）细胞受表观遗传机制调控。最近一项研究报道EMT的主转录因子TWIST对肿瘤起始、转移以及促进CSCs形成至关重要。此外，受端粒酶活性控制的端粒重复序列决定细胞增殖分裂能力，然而在CSCs中，由于端粒酶活性过表达，染色体长度不稳定，因此一定程度上赋予了CSCs自我更新能力。线粒体端粒酶活性还可通过降低ROS水平保护核DNA，从而产生抵抗治疗的CSCs。而有研究报道hTERT 基因中发生的突变可调节端粒酶活性，因此靶向端粒酶和hTERT基因有望成为根治肿瘤的方式之一。除了染色质结构重组，DNA去甲基化也是CSCs过度增殖分化，自我更新的机制之一。其中DNA甲基转移酶DNMT3A突变存在于20%的AML患者中，甲基化酶的共因子异柠檬酸脱氢酶（isocitrate dehydrogenase，IDH）突变存在于大多数胶质瘤患者中。IDH突变可以重新编程细胞功能并促进自我更新能力的获得。在正常的人类星形胶质细胞中，IDH1R132H过表达可增强细胞增殖能力并促进干细胞特性的获得。因此，CSCs可通过染色质空间结构重塑和DNA甲基化修饰等表观遗传学方式获得自我更新，过度增殖等功能，进而促进肿瘤发生和发展。
1.3 CSCs生物标志物
CSCs中存在特异性上调、下调、突变或者缺失的蛋白质或糖蛋白，这对CSCs检测和定位至关重要，也是作为生物标志物的重要条件。这些蛋白质与糖蛋白有的是细胞表面抗原，也有的存在于细胞质中，如位于细胞质中的可溶性蛋白质醛脱氢酶1（aldehyde dehydrogenase，ALDH1）的活性增强与CSCs生物学特征相关。目前CSCs生物标志物检测过程中主要面临的问题是特异性不高，因此使用多种标志物共同识别CSCs更可靠。大部分研究中常用细胞表面标志物检测肿瘤中的CSCs，例如乳腺癌中的CD44、CD24、CD133、ALDH1，结直肠癌中的CD29、CD166、CD133、 EpCAM等，脑癌中的CD90、CD133、CD15，皮肤癌中的CD20、CD271等，肝癌中的CD44、CD90、CD13等，肺癌中的CD44、CD133、CD166等。
在CSCs形成过程中，通常是在错误的时间和位置上重新激活了在早期胚胎发生过程中活跃的信号通路。目前已知的调控细胞干性特征的信号通路主要有6条，包括Hedgehog、JAK/STAT、Nanog、Notch、PI3K/AKT和Wnt/β-catenin通路。这些信号通路的激活使CSCs具有更强的增殖、迁移能力，并介导原发性或继发性肿瘤生长。同时，这些信号通路相关的调控分子也成为CSCs特异性生物标志物。此外，对CSCs保持自我更新能力的重要转录因子，如SOX2、NANOG、OCT4、KLF4和c-MYC也是潜在的靶点。还有研究发现子宫内膜样癌中的CD55信号传导（衰变加速因子）可以调节自我更新和介导耐药，且基本的多能转录因子NANOG、SOX2和OCT4等均受CD55调控，这些因子是CSCs维持的重要因素，也有潜力作为CSCs生物标志物或治疗靶点。
1.4 CSCs微环境特征
复杂的局部肿瘤微环境是CSCs形成和维持的重要因素，包括间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）、内皮细胞、肿瘤相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblasts，CAFs）和免疫细胞［包括肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages，TAMs）、可调节T细胞（T cells regulatory，Tregs）、髓样抑制细胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）和T辅助细胞17（T help cell 17，Th17）］。一方面，CSCs可通过这些基质细胞相互作用，重塑肿瘤微环境，有利于CSCs 的形成与维持。另一方面，这些基质细胞可分泌不同的细胞因子和生长因子，刺激CSCs的自我更新与增殖分化，促进肿瘤发生、进展和免疫抑制。例如，CSCs 通过分泌HGF和CCL2，促进纤维母细胞分化为CAFs，而CAFs可通过分泌纤维胶原蛋白，为CSCs提供机械支持，分泌细胞因子CXCL12和生长因子（肝细胞生长因子、血管内皮生长因子等），促进肿瘤细胞增殖、侵袭和转移。有研究报道CAFs也参与相关的EMT过程，通过分泌TGFβ1促进CSCs异质性形成，是浸润和转移过程的早期步骤。
CSCs在临床治疗和预后中的作用
2.1 CSCs诱导肿瘤耐药及复发
CSCs一个显著的特点是能抵抗传统化疗和放疗。常见的耐药机制包括ABC转运蛋白表达增加、低活性氧（reactive oxygen species，ROS）状态、抗凋亡途径激活和DNA修复系统激活等。放疗和化疗主要通过增加ROS水平杀死肿瘤细胞，然而CSCs可降低细胞内ROS水平，从而保护自身免受电离辐射和化疗药物的杀伤。研究显示，KEAP1-NRF2途径是ROS的主要调节剂，肺癌中该途径的突变可使细胞对ROS具有抵抗力，因此大多数伴KEAP1-NRF2突变的Ⅱ期或Ⅲ期肺癌患者放疗后会复发。化疗药物以快速分裂细胞为靶点，然而CSCs在化疗期间可处于生长周期静止或者休眠状态，因此化疗药物无法杀伤这部分肿瘤细胞。同时，化疗药物造成局部肿瘤微环境的改变还会进一步刺激CSC内信号通路激活，使之适应局部微环境，从而致使肿瘤复发与恶化。此外，这些由CSCs重建而来的肿瘤组织包含了更高比例的耐药性CSCs，因此具有更强的放化疗抵抗能力。还有研究显示，放疗可通过激活TGF-β信号通路诱导EMT并促进肿瘤细胞转移，放射线照射癌细胞可增加EMT相关基因（如SNAIL 和TWIST）表达，从而使肿瘤细胞更具侵袭性且对治疗产生抵抗。
2.2 CSCs相关生物标志物与临床预后
近年来，大量研究数据显示肿瘤组织中CSCs的存在与患者预后密切相关。目前大多数研究表明CSCs生物标志物高表达可导致患者不良预后，主要表现为缩短的总生存期（overall survival，OS）或无病生存期（disease-free survival，DFS）。在乳腺癌、肺癌、胃癌、胰腺癌和结直肠癌中，CD133表达上调的患者预后较差。ALDH1的表达在神经胶质瘤、肺癌、卵巢癌和乳腺癌中均与不良结局相关。尽管CSCs生物标志物在肿瘤诊断以及预后评估中具有重要的参考价值，但目前尚未发现适用于所有肿瘤类型的CSCs生物标志物。例如，在肺癌和结直肠癌中，CD44表达与患者OS无明显相关性，但在乳腺癌和胃癌中其与较差的生存结局高度相关。也有研究显示CSCs标志物表达与肿瘤进程无明显相关性，但与较好的预后相关，这种矛盾的研究结果的产生可能与多种因素有关。例如，生物标志物的表达水平可能与癌症进展阶段相关，有研究显示，ALDH1表达水平与FIGO分期以及黏液癌组织学分型密切相关。CSCs生物标志物的表达还可能与疾病状态和治疗阶段相关，有研究发现在雌激素受体阴性（ER-）乳腺癌中，ALDH1表达水平与OS和DFS密切相关，ALDH1 表达升高的患者预后更差，更早出现淋巴结转移。然而，在人表皮生长因子受体2（human epidermalgrowth factor receptor 2，HER2）阳性的原发性乳腺癌中，ALDH1表达水平与OS和DFS无关。因此认为，采用多种生物标志物组合进行预测分析更具有可靠性。在乳腺癌中CD44 /CD24-组合预测患者预后的结果更具准确性和一致性，多项研究也发现该表型乳腺癌与较差的OS、DFS和PFS相关。对这些生物标志物进一步的组合分析发现，CD44 /CD24-、ALDH1A1、ALDH1A3、integrinα6、CD133、EpCAM和Ki-67的不同组合结果，在不同表型不同阶段的肿瘤中预后结果也不同。
CSCs靶向治疗
CSCs对传统化疗和放疗均呈抵抗状态，因此特异性针对CSCs的靶向治疗成为肿瘤领域研究的热点之一。目前已有多种CSCs相关靶向药物处于研究中，其中Vismodegib和Sonedegib是已经FDA批准的靶向CSCs内相关信号通路的药物，两者均可抑制Smoothened，从而抑制基底细胞癌中的Hedgehog信号通路。另一种靶向治疗药物Duvelisib为PI3K-δ和PI3K-γ双抑制剂，其中PI3K-δ参与白血病和淋巴瘤细胞的存活和增殖，而PI3K-γ则有助于细胞分化和迁移。Duvelisib适用于治疗复发性或耐药性慢性淋巴细胞白血病或小淋巴细胞淋巴瘤患者。虽然这些已批准的药物均未定义为CSCs靶向药物，但是这些药物靶点在CSC内信号通路激活中具有关键作用，也表明其对CSCs存在潜在的抑制功能。Palbociclib是第一种经FDA批准用于治疗癌症的CDK4/6抑制剂，特别是激素受体阳性和HER2阴性乳腺癌，Palbociclib可抑制其CSCs自我更新。Reparixin是一种主要用于治疗胰腺移植患者的辅助药物，但体外和小鼠肿瘤模型研究中已证实其具有杀死CSCs的能力。
目前也有不少靶向CSCs的药物在临床试验中失败，其中很重要的一个原因是未能正确识别不同状态下的CSCs。在增殖期和静止期的干细胞中激活的信号通路可能不同，如在皮肤和其他组织中，存在静止期和增殖期干细胞。增殖的干细胞依赖于Wnt信号传导，但静止的干细胞并不依赖于Wnt信号。因此，针对Wnt信号的靶向药物可能会消除增殖的干细胞，但不会消除静止的干细胞。治疗失败的另一个主要原因是这些靶向药物同时靶向正常干细胞和CSCs，如靶向基因方法（例如癌基因MYC）中针对以组蛋白乙酰化（BET途径）的表观遗传调控BET家族为靶点药物。因此，在某些情况下，最大有效剂量的BET途径抑制剂可能对正常肠道干细胞和CSCs具有同等毒性，导致严重的胃肠道毒性。CSCs靶向治疗的效果与传统治疗也不同，如绝大多数的普通肿瘤细胞不会立即减少。因此，为了达到更好的治疗效果，CSCs靶向治疗需与其他传统肿瘤治疗方法（如手术、化疗和放疗）结合。在理想情况下，肿瘤患者应尽早使用CSCs靶向治疗，因为早期CSCs细胞数量较少且CSCs内的耐药相关信号通路未被激活。此外，抗CSCs治疗也可作为维持治疗，有助于防止肿瘤复发，延长生存期。同时，由于CSCs在很大程度上受免疫微环境调节，例如造血干细胞及其他干细胞通过表达CD47逃避巨噬细胞的吞噬作用。一项关于耐药性非霍奇金淋巴瘤患者的研究中，CD47的抑制性抗体可恢复50%的患者对利妥昔单抗的敏感性，且有36%的患者达到完全缓解。因此，将CSCs靶向治疗与免疫激活治疗相结合有可能成为彻底根除癌症的新方法。
小结
在肿瘤发生发展过程中，CSCs是导致肿瘤耐药、复发、转移的重要因素。CSCs主要起源于原始细胞的基因突变累积，自我更新程序激活，衰老和凋亡程序失活。表观遗传学调控不仅是肿瘤细胞异质性形成的重要原因，也是CSCs改变代谢途径和细胞表型获得自我更新能力和耐受低氧低营养微环境的重要途径之一。肿瘤微环境中各种细胞间通过细胞因子相互作用，共同为CSCs的维持提供有利环境。基于CSCs特殊的生物学特征，临床上可利用相关生物标志物的特异表达进行CSCs检测和定位，为临床诊断和预后分析提供有效依据。CSCs生物标志物的表达往往与临床病理特征密切相关，包括肿瘤低分化组织类型、TNM分期增加、血管浸润、肿瘤浸润深度、淋巴结转移和远处转移等。从目前生物标志物的预测效果来看，今后还需要探索更准确、更具一致性的生物标志物以及其他类型的CSCs筛选方式。处于缓慢增殖期或休眠期的CSCs是肿瘤耐药及复发的重要因素，因此靶向CSCs治疗是根治肿瘤的潜在希望。
随着CSCs相关生物学研究的深入，其临床转化研究前景广阔，但尚处于起步阶段，还有许多问题需要解决。首先，最重要的是需要更好地定义正常干细胞以及各种肿瘤组织中CSCs的细胞生物学分子特征。由于CSCs中存在各种致癌突变的累积，CSCs的增殖和分化不仅依赖特定基因。显然，靶向多种CSCs相关途径的联合疗法及同时针对静止期和增殖期CSCs的靶向药物能更好地根除肿瘤细胞。例如，AML的复发与白血病干细胞和白血病前干细胞的存在密切相关。这些细胞每年约以1%的频率引起晚期复发。但相对于CSCs，这些恶变前细胞的分子和细胞生物学特征的复杂性较低，因此如果在癌症出现之前能够消除这些白血病前干细胞以及未来有可能成为CSCs的前体细胞，治疗将更有效。利用单细胞基因表达检测技术为肿瘤患者定制特异性靶向药物，也有望清除所有肿瘤再生细胞，小分子抑制剂、生物制剂和针对CSCs的靶向免疫疗法组合也有望进入临床并改善患者预后。
作者：李聪 徐兵河
作者单位：国家癌症中心/国家肿瘤临床医学研究中心；中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院