正确制作使用猪自家疫苗技术
近年来随着我国生猪养殖规模和养殖数量的增加，引进的外来品种越来越多，市场的流动性增大，各养殖猪场在消毒、防疫、治疗措施等方面也存在很多空白的地方，造成现在各种猪病的广泛发生和传播，也使得当前猪病的特点呈现多样化和复杂化。当前某些疾病的暴发使得国内市场上还没有针对该疾病的确切免疫保护效果的商品疫苗供应，因此为了挽救不可估量的经济损失，有的猪场使用自制自家疫苗免疫。尽管有关专家呼吁不能长期或随意使用自家疫苗，但自制自家疫苗还是经常被用来在特定时期救急，提醒广大养殖朋友对于自家苗一定要正确制作、谨慎使用。
1、材料与方法
1.1.仪器设备 37℃恒温培养箱、洁净组织搅碎机、解剖刀、电子天平、烧杯、绞肉机、不锈钢圆盘、量筒、玻璃棒、漏斗、灭菌纱布、100毫升灭菌疫苗瓶、干热高温灭菌箱、无菌操作台、酒精灯、灭菌平皿、EP管架、移液器及其灭菌枪头、镊子、接种环、摇菌床、瓶盖封口机、灭菌移液管(10毫升)、250毫升细胞瓶、酸缸、吸耳球、C02培养箱、倒置显微镜、4℃冰箱、-20℃冰箱、-80℃冰箱、匀浆机等。
1.2材料试剂 生理盐水、蒸馏水、甲醛溶液、症状典型的病料、TSA、TSB、DMEM(营养液含10%小牛血清和氨基葡萄糖、维持液含2%小牛血清)、PK-1.5细胞、双抗(青、链霉素)、胰蛋白酶等。
1.3自家苗制作
1.3.1自家组织苗制作 选取患有典型症状且没有用抗生素治疗的病猪，用解剖刀宰杀放血，剖开胸腹部，选取肺脏、脾脏、淋巴结(主要是腹股沟淋巴结和肠系膜淋巴结)等器官作为主要病料，如果肝脏和肾脏病变较明显，也可选取病变明显部位作为辅助材料，但要尽量保证病料的新鲜，防止其他杂菌污染，以确保组织苗的效果。如果不能及时处理病料，则需要把病料密封好放在-80℃低温处保存。将选取的病料放在已灭菌的绞肉机中绞2～3次，试估计其重量。取相当于病料重量25%～35%的生理盐水加入病料中混匀，放人组织捣碎机中捣碎.12000转/分钟捣碎约2—3分钟，将捣碎的病料放入不锈钢圆盘中密封，最后放人冰箱中冷冻，完全冻结的病料取出后溶解，如此反复冻融三遍，再将解冻的病料与生理盐水按1千克：3500—4000毫升的比例进行稀释调兑，之后用双层无菌医用纱布过滤，然后将过了两层纱布的滤液再过两次四层纱布，最后所得滤液中加入0.8%的甲醛，一小时摇匀后，置37℃恒温箱中灭活，灭活时间不能太短。灭活期间，每4～6小时摇动一次约半小时，48小时后灭活完毕，分装前按1500国际单位/毫升比例加入双抗(青霉素和链霉素)，另外还可加入一定量的黄芪多糖并摇匀，以增加猪只抗体的生成，再移至无菌操作台中无菌分装于100毫升疫苗瓶中，封口后置于40℃ ~8℃下保存待用。
1.3.2自家细菌苗制作
取本场患有典型症状且未用抗生素治疗过的病猪，放血解剖，取猪体肺脏、脾脏、猪脑积液或患有关节炎的猪腿关节液于无菌操作台上接TSA平板。若无备用TSA固体平板，先密封病料于-20℃低温保存，并立即以蒸馏水和TSA粉末按24：1的比例调配TSA溶液并于114℃下灭菌16分钟，之后在水浴锅内冷却至45℃左右时于无菌操作台上加入5 %的无支原体小牛血清和0.15%的NAD并摇匀，同时倒制无菌TSA平板冷凝待用。接菌的平板于37℃恒温培养箱下保持生长约18小时左右直至菌落形成，观察菌落形态并进行细菌纯化、生化鉴定和革兰氏染色。据统计，当前临床猪细菌病当中主要以副猪嗜血杆菌、链球菌、巴氏杆菌、波氏杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、大肠杆菌等的原发或继发感染为主。TSA固体平板上鉴定纯化的细菌用TSB液体培养基洗下作菌液并转于500毫升葡萄糖瓶内的300毫升TSA液体培养基内37℃摇菌扩大培养约18小时，其中TSB液体培养基以蒸馏水和TSB粉末按33：.1的比例调配并于114℃灭菌16分钟，冷却后再加入1.2‰的NAD。扩大培养的细菌再以0.8%甲醛于37℃下摇床摇菌灭活20小时左右，灭活的细菌再接TSA平板37℃恒温培养18小时左右，根据平板上的细菌生长情况判断细菌甲醛灭活是否彻底。同时进行细菌计数和细菌浓缩，以判断抗原量和提高抗原量，若抗原量过大，可用灭菌生理盐水稀释。当验证已灭活彻底且抗原量达标的细菌方可于无菌操作台内无菌分装于100毫升疫苗瓶中，封口后置于4℃~8℃下保存待用。
1.3.3自家病毒苗制作
用于病毒分离的细胞主要是猪源猪肾细胞系，如PK-15细胞，它可用于分离猪瘟病毒、猪蓝耳病毒、猪圆环病毒、猪细小病毒、猪轮状病毒和猪冠状病毒等等。经酸缸处理并用清水洗净的细胞瓶干热高温灭菌后置于紫外灭菌的超净操作台内，用无菌洁净移液管往细胞瓶内加入30毫升DMEM营养液。同时用移液管加入5毫升左右的PK-15原代细胞并吹散混匀，置于37℃恒温C02培养箱内48小时，其间于倒置显微镜下观察细胞的生长情况，当细胞贴壁生长规律且无其他杂菌污染时便可进行下一步的细胞传代和放大培养。经48小时后的PK-15细胞瓶内残液于超净台内倒掉，同时无菌条件下往瓶内加入4毫升左右的胰蛋白酶溶液，使酶溶液浸没贴壁生长的细胞后立即倒掉，然后再无菌加入4毫升左右的胰蛋白酶溶液，置于37qC恒温培养箱保持3分钟左右，取出于倒置显微镜下观察细胞是否脱落分散，之后于超净台内再倒掉残液，再加入10毫升左右DMEM营养液并用移液管反复吹打，使得贴壁细胞充分吹散，然后吸5毫升左右细胞液转移至新的细胞瓶传代和放大培养。
取经PCR或RT-PCR检测为病毒感染阳性的病料约200毫克置于冷冻管内，加入0.1M(摩尔浓度)浓度的PBS缓冲液600微升，匀浆机以5米/秒匀浆30秒破碎组织病料，然后反复冻融已破碎的组织病料三遍使得组织内感染的病毒释放，12000rpm(每分钟转数)冷冻离心7分钟并取上清，上清液用灭菌注射器吸人并注入0.22微米孔径滤器过滤，滤液中加入双抗，并再次以相同孔径的无菌滤器过滤，所得滤液即为本场病料组织中所分得的含有双抗的病毒液，此病毒液可直接接上细胞使得病毒生长繁殖。待接毒的生长细胞以正好生长了36小时左右的细胞为宜，接毒之前应于超净台内倒掉细胞瓶中的营养液，然后无菌注入含有双抗的病毒液并在37℃下让病毒吸附细胞瓶中的细胞1小时，之后再往已接毒的细胞瓶内无菌加入DMEM营养液约35毫升并于37℃ C02培养箱内保持约的病毒液方可于无菌操作台内无菌分装于100毫升疫苗瓶中，封口后置于40℃—8