科研 | 华中农业大学：比较代谢组学揭示玉米与水稻的进化差异（国人佳作）
编译：李菲，编辑：Emma、江舜尧。
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代谢物质是指生物代谢过程的中间产物和最终产物。代谢物质在植物生长、进化和环境适应中起重要作用。但是，目前尚不清楚驯化过程如何影响植物的代谢物质组成。本文作者对玉米和水稻叶片和籽粒的代谢组学数据进行重新挖掘。对叶片代谢组数据进行主成分分析，可以清楚地分别水稻籼稻和粳稻品种。而温带和热带两个玉米亚种群则在主成分分析图中不能明显的区分开。水稻和玉米的籽粒代谢组表现出明显的种间差异，而在水稻种内，叶片和籽粒代谢组表现出相似的代谢变化。在10个代谢物类别中，黄酮类化合物在玉米中的变异性高于水稻，这表明黄酮类化合物是种间代谢差异的关键成分。此外，代谢物质间的相关关系网络，发生了大量的重组，表明玉米和水稻的差异进化过程。也许是由于这种差异，在水稻中鉴定出的代谢物质间相互作用显著多于玉米。在水稻中，叶片中的代谢物质比籽粒中的具有更强的代谢相互作用。本文的结果表明，代谢组学数据可以补充并扩展哪些特征导致了玉米和水稻种间分化的信息，对于追踪进化史非常有价值。
论文ID
实验设计
本研究使用的代谢组数据是合作实验室之前发表在nature genetics/nature communication的论文数据，从一个新的角度（进化）进行分析。玉米籽粒代谢组的数据，来自368个遗传背景迥异的玉米自交系。水稻叶片和籽粒的代谢组数据，来自524个世界各地不同水稻品种。使用R包“lme4”进行混合线性模型分析，获得每个代谢物质的最佳线性无偏预测器（BLUP）值，作为代谢物质的表型数据，用于后续分析。
为了解玉米和水稻的种内变异模式，将玉米种系分为热带、温带和混合来源种质，可用于分析驯化后适应机理，而水稻种系分为籼稻和粳稻，分析亚种分化机理。使用具有自动拟合模型的SIMCA-P13.0版软件进行主成分分析（PCA）和聚类分析。使用t检验比较了温带玉米和热带玉米之间，籼稻和粳稻之间，每种代谢物质的平均值（p<0.01）。分别估算了水稻谷粒、叶片和玉米籽粒中每种代谢物类别中差异代谢物的比例。使用R包“binom.test”进行二项式检验，来进行比例比较，以水稻和玉米籽粒为例，假定水稻籽粒中的比例为零比例，然后将其与玉米籽粒中观察到的比例进行比较。比较水稻籽粒和玉米籽粒中某一代谢类别中差异代谢物的比例，不同比例的差异代谢物的类别可能与水稻和玉米之间的差异进化有关。类似的，比较水稻叶片和籽粒组织间每种代谢物类别的显著差异比例，该结果反映了代谢的时空差异。此外，种内的代谢变异，是通过变异系数（CV）测量的。
使用R包“cor.test”在计算玉米或水稻种内代谢物和代谢物之间的Pearson相关性。使用R包“pheatmap”绘制显示代谢物间关系的热图。使用软件Cytoscape 3.2.0版绘制代谢物网络。为了总结显着的代谢相关性，进行了1,000个排列检验以确定相关系数（r）和p值的阈值。
结果
1. 玉米和水稻种内代谢组的分化
主成分分析结果显示，水稻叶片代谢组数据可以将籼稻和粳稻区分开。玉米株系间不能完全分开（图1B）。水稻籽粒的代谢组数据中，黄酮类代谢物质可以清楚地区分开籼稻和粳稻。水稻叶片中，黄酮类代谢物质也可以区分开籼稻和粳稻，其它类别的代谢物质（酚酰胺，多酚等）也可以（图1B）。对于玉米种内的各个株系，代谢组数据都没有区分能力，单个化合物类别的结果比使用整个代谢组数据的结果还要差（图1B）。这些结果表明，关键的代谢物，如类黄酮和酚酰胺等，可能在玉米和水稻的驯化中起着至关重要的作用。
为了研究与稻米和玉米分化同时发生的代谢变化，我们集中于水稻和玉米籽粒的代谢数据。籽粒是农作物驯化的关键器官。
在玉米和水稻内部的亚种群之间，表现出显著不同的平均值（p<0.01）的代谢物被认为与其种内进化有关。水稻亚种的分化伴随着籽粒中的氨基酸衍生物类别中43.5％代谢物质的变化，籼稻和粳稻之间这些代谢物质的平均值呈现出显著的不同，大大高于驯化导致温带和热带玉米之间14.3％这类代谢物质的变化（p = 6.74×10-4）。此外，籼稻和粳稻之间约有33.3％的多酚相关代谢物发生了变化，而温带和热带玉米之间则没有观察到这类代谢物质的差异（p <2.20×10-16）。温带和热带玉米品系之间，平均39.8％（0.0％至71.4％）的代谢物质的水平发生了变化。相比之下，籼稻和粳稻之间，则有56.0％（33.3％至83.3％）的代谢物质的水平发生了变化（图2A）。这些结果表明，水稻和玉米之间存在相当大的进化差异，而且可能涉及几种关键的代谢物质。
图2 玉米和水稻之间的代谢组
（A）各个代谢物质类别中驯化相关代谢物的比例。（B）各个代谢物质类别中种内变异系数。使用玉米和水稻籽粒的代谢数据作图。玉米和水稻之间驯化相关代谢物质的比较基于二项式检验，而玉米和水稻种内变异比较基于t检验。显著性阈值p <0.05。
3. 水稻时空代谢变化
作者比较了水稻各个品系籽粒和叶片的代谢组数据。几乎所有的代谢物类别中，籼稻和粳稻之间表现出差异的代谢物，水稻叶片中的比例均高于籽粒，特别是黄酮类化合物（p = 1.67×10-12）、酚酰胺类（p = 7.72×10-4）和多酚类化合物（p = 4.66×10-5）（图3A）。唯一的例外是，维生素类化合物。此外，叶片中，籼稻和粳稻之间的代谢物平均有73.8％（从40.0％到90.4％）表现出显著差异，而籽粒中，籼稻和粳稻之间有56.0％（从33.3％到83.3％）的代谢物质表现出显著差异（图3A）。籽粒中的氨基酸和核酸衍生物类代谢物似乎比叶子中的更多样化（图3B）。
4. 玉米和水稻的二维代谢变化
作者计算了代谢物质之间的相关性。基于这些相关关系，作者建立了玉米和水稻的代谢网络（补充图表）。代谢网络的拓扑结构对不同的时空发育阶段和进化过程做出了显著的改变。
此外，作者发现，玉米籽粒中，多种代谢类别（包括氨基酸、类黄酮、氨基酸衍生物、脂质和核酸衍生物）中的相关性显著高于水稻（图5A）。在水稻中，叶片在所有代谢物类别中，始终表现出比籽粒更高的相关性（图5B）。通过比较物种中的两个亚种群，发现在籽粒中，籼稻中氨基酸衍生物、类黄酮和脂质的代谢相关性显着低于粳稻品种（p <0.05），但是，叶中显示出相反的模式：籼稻品种的氨基酸和类黄酮的代谢相关性要比粳稻品种强得多。
讨论
目前，关于代谢组如何参与植物进化过程的知识仍然不明确。作者提供了代谢组学的线索，以更好地解释水稻和玉米之间的差异进化。
1. 代谢角度解读玉米和水稻进化
本研究中，基于代谢组学数据对玉米进行的聚类分析，发现一定比例的温带来源玉米品系聚集在热带品系附近，反之亦然，这可以用混合起源或热带种质的基因渗入来解释。该结果表明，代谢组学数据对于区分大多数热带和温带玉米品系具有一定的价值，但尚不及水稻亚种的程度。
水稻驯化的许多问题仍然存在争议，例如其地理起源、直接的野生祖先以及栽培稻的两个亚种是起源于一次还是多次驯化事件。聚类分析表明，代谢组学可用于区分籼稻和粳稻品系。此外，聚类分析的结果似乎支持单个驯化事件，因为水稻在多个驯化事件中同时分离为籼稻和粳稻的可能性非常低。因此，代谢组学分析可以提供更多角度，甚至可能更有效地探索农作物的进化史。
2. 玉米和水稻驯化的关键代谢物质
本研究中，许多代谢物质在温带和热带玉米品系间，或粳稻和籼稻之间，表现出明显不同的含量（图2、3），这表明它们参与了驯化过程。在玉米中，热带品系在大多数代谢物类别中均表现出比温带品系显着更大的差异，这表明玉米驯化后从热带气候到温带气候，可能涉及一系列新陈代谢调控。
类黄酮是一类含有C6-C3-C6骨架的次级代谢物质，可保护植物免受病原菌和紫外线辐射的危害。酚酰胺广泛存在于许多植物中，在植物防御生物胁迫、非生物胁迫以及发育中发挥作用。在本研究中，发现玉米和水稻种内各个品系之间存在许多代谢物差异，其中，黄酮类化合物是所有代谢类别中检测到最多的代谢物（图1）。黄酮类化合物在水稻（45％）和玉米（36％）的品系之间差异很大。PCA结果表明，黄酮和酚酰胺类代谢物质具有很高的区分玉米或水稻品系的能力（图1B）。这些结果表明黄酮和酚酰胺类化合物是水稻和玉米差异进化的关键代谢物质。
3. 代谢网络在植物进化时的重塑