科研 | Nat Commun：靶向RAGE衔接蛋白SLP76治疗致死性脓毒症
编译：微科盟橙子，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。
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越来越多的证据表明RAGE在脓毒症的发病机制中具有重要作用，然而，RAGE在感染性休克期间向下游激酶级联传递信号的机制尚不清楚。在本研究中，我们确定SLP76在体外和体内都是RAGE胞浆尾部的结合伙伴，并证明SLP76通过其不育α基序（SAM）与RAGE结合，介导下游信号传导。RAGE或SLP76基因缺陷可降低AGE诱导的p38 MAPK、ERK1/2和IKKα/β的磷酸化以及细胞因子的释放。通过TAT细胞穿透肽将SAM结构域传递到巨噬细胞中，可以阻止促炎细胞因子的产生。此外，TAT-SAM可减轻盲肠结扎和穿刺（CLP）小鼠的炎性细胞因子释放和组织损伤，并保护这些小鼠免受败血症的致死。这些发现揭示了SLP76在RAGE介导的促炎症信号中的重要作用，并为SLP76靶向治疗败血症的研究提供了线索。
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实验设计
1. 利用T7噬菌体展示系统进行了生物扫描，以确定与RAGE的胞浆尾部相互作用的潜在蛋白质；
2. Co-IP试验确定SLP76与RAGE的相互作用以及互作结构域；
3. 生物信息学分析RAGE中包含几个潜在的磷酸化位点；
4. 通过酶联免疫吸附试验（ELISA）测定了细胞因子水平，探讨SLP76在RAGE介导的细胞因子和趋化因子释放中的作用；
5. 评估TAT-SAM肽是否能保护CLP模型中的小鼠免受感染性休克。
实验结果
1. 噬菌体展示筛选RAGE结合肽
RAGE在大多数免疫细胞表面呈组成性表达，许多基因敲除小鼠或特异性抑制剂的实验研究表明，阻断RAGE可减少与脓毒症病理有关的各种促炎介质的产生，延长CLP24小鼠的生存时间。为了阐明RAGE介导的信号传导过程的机制及其在脓毒症发病机制中的重要性，我们利用T7噬菌体展示系统进行了生物扫描，以确定与RAGE的胞浆尾部相互作用的潜在蛋白质（图1a）。经过三轮生物筛选，我们从洗脱液中获得T7噬菌体克隆。经过三轮生物筛选，从洗脱液中获得T7噬菌体克隆。第1-3轮回收的噬菌体的pfu值分别为2.0×109、1.2×108和1.4×108pfu，尽管每轮输入的噬菌体数量相同（2.0×1011pfu）（补充图1a）。相应地，噬菌体富集率在两轮生物淘洗后保持相对稳定（补充图1b）。通过对富集的噬菌体进行DNA测序，我们确定了11种候选蛋白作为RAGE胞浆尾部的结合伙伴（补充表1）。在功能和结构分析的基础上，我们对衔接蛋白SLP76进行了进一步的研究。
2. SLP76与RAGE胞质结构域的相互作用
据报道，RAGE的细胞质结构域对RAGE配体激活细胞内信号级联起着关键作用。为了证实SLP76与RAGE的结合活性，我们从细菌中纯化了重组谷胱甘肽S-转移酶（GST）、GST标记的RAGE胞浆尾部（GST-RAGE（CT））和His标记的SLP76（His-SLP76）蛋白（补充图2），我们将融合蛋白His-SLP76与GST或GST-RAGE（CT）孵育，用Ni2+-NTA树脂进行下拉实验以评估SLP76与RAGE的相互作用。共沉淀试验结果表明，GST-RAGE（CT）而非GST被His-SLP76拉低（图1b），表明SLP76与RAGE的胞浆尾部相互作用。为了进一步阐明RAGE和SLP76在体内的相互作用，在不同剂量AGEs处理后，我们用HA偶联（图1c）或Flag偶联（图1d）珠在HEK293细胞中共转染表达HA标记RAGE和Flag标记SLP76的质粒，进行共免疫沉淀（Co-IP）实验。RAGE和SLP76之间AGE诱导的相互作用也在不同时间观察到（图1e）。这些结果表明，暴露于AGEs后，RAGE和SLP76的结合具有剂量和时间依赖性（图1c-e）。我们采用Co-IP法检测RAW264.7细胞中SLP76与RAGE的相互作用。在AGEs刺激15分钟后，SLP76主要由抗RAGE的特异性抗体沉淀（图1f），这些结果证实SLP76是RAGE胞浆结构域的结合伙伴。
图1 SLP76作为RAGE胞内结构域结合蛋白的鉴定
a T7噬菌体展示系统用于筛选与RAGE胞浆尾部结合的潜在蛋白质的示意图。b RAGE胞质结构域与SLP76的体外结合。体外结合用重组GST-RAGE（CT）和His-SLP76蛋白进行评估。c RAGE与SLP76的剂量依赖性相互作用。d 将RAGE向绑定到SLP76。SLP76和RAGE之间的相互作用通过（c）中所述的程序进一步证实，该程序具有针对用于反向免疫沉淀的Flag标签的特异性抗体。e RAGE与SLP76的时间依赖性相互作用。将表达Flag-SLP76和HA-RAGE的质粒共转染HEK293细胞，用AGEs（100 μg/ml）处理不同时间，观察SLP76与RAGE的相互作用。f RAGE与SLP76的内源性相互作用。用AGEs（100μg/ml）刺激RAW264.7细胞15min后，用RAGE特异性抗体裂解RAW264.7细胞进行免疫沉淀，以证实RAGE与SLP76的内源性相互作用。
3. RAGE和SLP76结合域的识别
RAGE和SLP76都有许多功能域（图2a）。为了鉴定RAGE和SLP76中的相互作用域，产生了几个RAGE突变体，包括具有胞浆尾部缺失、Ddomain样对接位点（D）缺失和远端C末端（DCT）结构域缺失（RAGE的胞浆部分没有D结构域对接位点）的突变体。Co-IP分析结果表明，RAGE的胞浆尾部结构域是RAGE与SLP76结合所必需的。此外，RAGE的DCT区域对于与衔接蛋白SLP76结合是必不可少的（图2b）。对SLP76的磷酸酪氨酸位点突变体（Y113A、Y128A和Y145A）和SAM结构域缺失突变体（ΔSAM）的平行实验表明，SAM结构域缺失显著降低了SLP76和RAGE之间的相互作用（图2c）。与此结果一致，荧光共振能量转移（FRET）分析结果也表明SAM结构域缺陷显著降低了荧光能量转移的效率（图2d-e）。我们用合成肽进行表面等离子体共振成像（SPRi）分析，确定SLP76的SAM结构域与RAGE的胞浆尾部的结合亲和力。我们发现SLP76的SAM结构域和RAGE的胞浆尾部之间存在剂量依赖性结合（补充图3）。总之，这些发现表明SLP76和RAGE之间的相互作用是由SLP76的SAM结构域和RAGE的DCT区域介导的。
图2 鉴定介导RAGE和SLP76相互作用的功能域
a RAGE和SLP76的蛋白质结构域的示意图。 RAGE（上图）和SLP76（下图）的特定域/图案以不同的颜色显示。构建了RAGE和SLP76的不同截短或突变体，分别显示在上面板和下面板中。 b 映射与SLP76绑定的RAGE区域。带有标记的全长SLP76和带有HA标记的WT RAGE或其缺失突变体在HEK293细胞中过表达。用或不使用AGEs（100μg/ ml）处理15分钟后，收集细胞进行裂解。用针对HA标签的特异性抗体进行免疫沉淀，以检测RAGE和SLP76之间的相互作用（n = 3）。 c 识别与RAGE相互作用的SLP76的功能域。 HA标签的全长RAGE和Flag标签的WT SLP76或其突变体在HEK293细胞中过表达。进行了针对HA标签的特异性抗体的免疫沉淀，以鉴定SLP76与RAGE相互作用的域（n = 3）。 d SAM域介导RAGE和SLP76之间的体内相互作用。表达ECFP标签的RAGE和EYFP标签的SLP76或SLP76（ΔSAM）的质粒在HEK293细胞中共表达。进行FRET分析以验证SLP76的SAM结构域与RAGE的结合活性（n = 5）。e 定量RAGE和SLP76的体内相互作用（n = 5）。
4. AGEs对巨噬细胞促炎信号通路的影响
为了探索AGEs治疗中RAGE介导的下游信号事件的机制细节，我们用针对磷酸化激酶的特异性抗体进行了western印迹，发现在RAW264.7细胞中有丝分裂原活化蛋白激酶（MAPK）和IKKα/β信号通路被动态激活（图3）。然而，RAGE介导的MAPK通路激活可能是选择性的；事实上，我们的结果表明，AGEs治疗15分钟后，p38 MAPK和ERK1/2的磷酸化（图3a-c）而不是JNKs（补充图4）显著增加（P<0.05）。为了研究AGEs对RAGE剂量依赖性激活的影响，我们将RAW264.7细胞与不同剂量的AGEs孵育15分钟，发现随着AGEs浓度的增加，p38 MAPK、ERK1/2和IKKα/β的磷酸化显著增强（图3d-f）。
总之，这些结果表明，在巨噬细胞中，由AGE刺激诱导的促炎症信号通路，包括p38 MAPK、ERK1/2和IKKα/β通路的激活是一个剂量和时间依赖性的过程。
图3 AGEs对巨噬细胞促炎信号通路的影响
a-c AGEs诱导RAW264.7细胞p38 MAPK、ERK1/2和IKKα/β的活化动力学。用AGEs（100μg/ ml）处理不同的时间（0–240分钟）后，收集RAW264.7细胞进行Western印迹分析。抗磷酸化（上图）或总（下图）p38 MAPK（a），ERK1 / 2（b）或IKKα/β（c）的特异性抗体。d-f AGEs刺激RAW264.7细胞p38 MAPK、ERK1/2和IKKα/β的剂量依赖性激活。RAW264.7细胞用AGEs按指定剂量处理15分钟。用特异性抗体进行蛋白质印迹，以检测p38 MAPK（d），ERK1 / 2（e）和IKKα/β（f）的磷酸化。蛋白带密度用ImageJ软件进行定量，并以磷酸化激酶相对于相应总激酶的倍数变化（FC）表示。
为了评估SLP76在RAGE介导的细胞活化中的作用，我们将表达HA标记RAGE或Flag标记SLP76的质粒转染到HEK293细胞中，并用特异性抗体进行western印迹以检测AGEs刺激15分钟后信号分子的磷酸化。RAGE或SLP76过表达的细胞在AGE诱导的细胞凋亡中p38 MAPK、ERK1/2和IKKα/β的磷酸化只表现出轻微或甚至没有变化，但是RAGE和SLP76共表达的细胞显示这些信号分子的磷酸化显著增强（图4a-d）。
为了证明RAGE和SLP76之间的相互作用是AGE诱导的RAW264.7细胞活化的原因，我们使用siRNA沉默RAW264.7细胞中内源性SLP76或RAGE mRNA的表达（补充图5a，b）。当RAGE和SLP76的基因表达被敲除时，p38 MAPK、ERK1/2和IKKα/β的磷酸化显著降低（图4e）。骨髓源性巨噬细胞（BMDM）的平行实验表明，AGR或SLP76的遗传缺陷显著抑制AGE诱导的p38 MAPK、ERK1/2和IKKα/β的磷酸化（图4f）。
为了进一步研究RAGE和SLP76突变体对激酶磷酸化的影响，通过转染在HEK293细胞中过表达RAGE和SLP76突变体。有趣的是，当SLP76的RAGE或SAM结构域的DCT被删除时，AGE诱导的p38 MAPK、ERK1/2和IKKα/β的磷酸化被显著抑制（图4g，h）。
生物信息学分析显示RAGE蛋白的胞质区包含几个潜在的磷酸化位点，包括Y391、Y399、Y400和T401。在过度表达RAGE酪氨酸磷酸化位点突变体的细胞中，与过度表达野生型（WT）RAGE的细胞相比，RAGE介导的信号传导没有显著影响（补充图6）。
总之，这些结果表明SLP76对RAGE激活介导的细胞信号传导至关重要，SLP76的SAM结构域和RAGE的DCT不仅是RAGE与SLP76相互作用所必需的，而且也是AGE/RAGE轴介导的信号转导所必需的。
图4 SLP76在RAGE介导的促炎症信号通路激活中的作用
a RAGE和SLP76过度表达对AGEs处理的HEK293细胞促炎症信号通路的影响。b–d 通过AGEs治疗激活的磷酸化蛋白激酶的定量。用ImageJ软件测定磷酸化p38 MAPK（b）、ERK1/2（c）和IKKα/β（d）的水平。e RAGE和SLP76对RAW264.7细胞AGE诱导的p38、ERK1/2和IKKα/β活化的影响。f 用AGEs（100μg/ml）处理从WT、AGER敲除（AGER−/−）和SLP76敲除（SLP76−/−）小鼠分离的BMDMs 15分钟。g 细胞内RAGE区域对AGE诱导的信号通路激活的影响。h 与RAGE相互作用的SLP76结构域在AGE诱导的p38 MAPK、ERK1/2和IKKα/β活化中的作用。
6. SLP76在AGE诱导的细胞因子和趋化因子释放中的作用
为了探讨SLP76在RAGE介导的细胞因子和趋化因子释放中的作用，我们合成了靶向AGER（siRAGE）或SLP76（siSLP76）的特异性siRNA。我们通过酶联免疫吸附试验（ELISA）测定了细胞因子水平，发现与对照siRNA（siCtrl）组相比，通过抑制RAGE或SLP76的表达，TNF和IL-6的释放被显著抑制（补充图7a，b）。
为了证实上述结果，Cyagen Biosciences（中国广州）设计并产生了SLP76基因敲除小鼠（补充图8）。从WT小鼠和AGER或SLP76缺陷小鼠中分离BMDM，以表征促炎基因的表达谱和AGEs诱导的细胞因子释放。AGR和SLP76基因缺陷导致促炎基因（包括Tnf、Il-1b、Il6、Ccl2、Ccl3和Cxcl10）的表达水平以及相应细胞因子和趋化因子的释放水平显著降低（图5g-l）。
上述结果合理地表明，SLP76介导的信号通路的中断可能导致促炎细胞因子的产生减少。因此，我们使用特异性抑制剂来研究信号通路在促炎细胞因子释放中的作用。相应地，我们发现p38 MAPK、ERK1/2和IKKα/β的特异性抑制剂显著降低了培养细胞上清液中TNF和IL-6的释放（补充图9）。
已有研究表明，TAT细胞穿透肽（CPP）能高效进入多种细胞系。因此，商业化合成的TAT-SAM融合肽（补充图10）将SLP76的SAM结构域递送到RAW264.7细胞中（图5m），用荧光显微镜观察TAT-EGFP融合肽对TAT的释放效率。如补充图11a、b所示，TAT介导的EGFP向RAW264.7细胞的传递呈剂量依赖性。在用TAT肽、TAT-SAM或TAT-RAGE（DCT）预处理1h后，我们用AGEs刺激RAW264.7细胞。与TAT组相比，TAT-SAM和TAT-RAGE（DCT）组中p38 MAPK、ERK1/2和IKKα/β的磷酸化显著受到抑制（补充图11c-e）。与此结果一致，给予TAT-SAM肽显著抑制AGE处理的RAW264.7细胞释放促炎细胞因子和趋化因子（图5n-s）。
综上所述，这些发现表明用TAT-SAM肽阻断RAGE和SLP76之间的相互作用不仅抑制促炎症信号通路，而且抑制AGE诱导的细胞因子释放。
图5 SLP76在RAGE介导的细胞因子和趋化因子表达中的作用
a-f AGER和SLP76基因缺陷对促炎细胞因子和趋化因子mRNA表达的抑制作用。从WT、AGR−/−或SLP76−/−小鼠中分离BMDM，然后在有或没有AGE的情况下刺激3小时。g-l AGR和SLP76基因缺陷对BMDM中细胞因子和趋化因子产生的影响。从WT、AGER−/−或SLP76−/−小鼠中分离BMDM，然后用或不用AGEs（100 μg/ml）刺激12小时。m TAT-SAM肽对RAGE介导的细胞信号传导的阻断机制。n-s 合成TAT-SAM肽对AGE诱导的细胞因子和趋化因子产生的影响。RAW264.7细胞用TAT-SAM肽或单独用TAT预处理1h，然后用AGEs刺激12h。
7. SLP76的SAM结构域作为脓毒症的潜在治疗靶点
先前的研究表明，血液中AGEs的增加与各种严重疾病有关。我们的数据显示，AGEs不仅在脓毒症患者中积累，在CLP小鼠中也是如此（图6a，b）。有趣的是，在AGEs水平降低后，DAMP分子高迁移率族蛋白B1（HMGB1）水平在CLP后6 h显著升高，并进一步升高，直到24 h观察期结束（图6c）。
HMGB1作为RAGE的功能性配体，被认为是脓毒症发生发展的关键因素。我们发现HMGB1处理也通过RAW264.7细胞中的SLP76激活促炎症信号通路，从而诱导RAGE介导的信号的长期激活（补充图12）。
基于上述发现，我们旨在评估TAT-SAM肽是否能保护CLP模型中的小鼠免受感染性休克。有趣的是，CLP后1h尾静脉注射TAT-SAM可显著降低CLP模型小鼠的死亡率。有趣的是，在CLP模型建立后1小时通过TVI给药TAT-SAM以剂量依赖性方式降低败血症小鼠的死亡率（补充图13）。给予TAT-SAM（10μM），而不是TAT肽，可以显著提高败血症小鼠的存活率（图6d）。与这一发现一致，血清分析表明，与对照组小鼠相比，TATSAM治疗组小鼠血清中各种促炎细胞因子的浓度较低（图6e-j）。此外，组织病理学检查显示，施用TAT-SAM肽对CLP小鼠肺和肝组织中的炎症浸润和组织损伤具有治疗作用（图6k）。同样，我们发现SLP76或AGR基因缺陷显著降低了血液和组织损伤中的细胞因子水平。值得注意的是，TAT-SAM处理的WT小鼠和AGER或SLP76基因敲除小鼠在细胞因子产生和病理生理学检查方面没有显著差异（补充图14）。
图6 合成TAT-SAM肽对脓毒症小鼠存活和细胞因子产生的影响
a 败血症患者血清中AGEs的升高。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定9例脓毒症患者和3例健康对照者血清中AGE水平。b 脓毒症小鼠血清中AGEs的时间依赖性增加。c 脓毒症小鼠血清中HMGB1的时间依赖性积累。d TAT-SAM肽对脓毒症小鼠存活的治疗作用。e-j TAT-SAM肽对脓毒症小鼠产生细胞因子和趋化因子的抑制作用。k TAT-SAM肽对脓毒症小鼠肺和肝组织损伤的保护作用。CLP后12小时，从小鼠收集肺和肝组织。肺组织切片的H＆E染色显示炎症细胞大量浸润（白色箭头），明显的肺泡间隔增厚和肺泡水肿（黑色箭头）。肝组织切片显示广泛的肝损伤和炎症细胞浸润（白色箭头）（n = 5）。
讨论
脓毒症是一种危及生命的疾病，与长期炎症、免疫抑制和器官损伤有关。用抗生素控制感染的进展是脓毒症和脓毒症休克的主要治疗策略。最近有人建议采用旨在抑制细菌成分或促炎介质生物活性的方法来治疗脓毒症患者；然而，这些方法在脓毒症患者中都没有令人满意的治疗效果。基于这些局限性，迫切需要开发新的脓毒症治疗策略。
长期以来，AGEs一直被认为是促进宿主细胞死亡、导致组织损伤和器官衰竭的有效有毒分子。据报道，AGEs参与了各种疾病的发展，包括糖尿病并发症、心血管疾病、神经退行性疾病以及衰老；此外，脓毒症患者血浆AGEs水平较高。与先前的研究一致，我们的研究表明，脓毒症患者血浆中AGEs的浓度高于健康对照组（图6a）。
RAGE是一种多配体细胞表面受体，在炎症和感染中起着关键作用。AGEs与RAGE的结合启动了不同的信号级联，有助于传染病的发病机制。然而，RAGE介导的信号通路非常复杂，其特点是许多配体（AGEs、HMGB1和S100蛋白）和多种细胞类型的广泛受体表达，包括内皮细胞、髓细胞、淋巴细胞和肿瘤细胞。RAGE介导的细胞反应不仅依赖于细胞类型、配体的特性和浓度、RAGE的表面量和可能的共受体的存在，而且还依赖于介导细胞内信号通路的不同衔接蛋白。
RAGE在败血症中的作用已在许多研究中得到证实，例如，AGR缺陷小鼠被证明对CLP引起的致死性多菌败血症具有保护作用。此外，在CLP模型小鼠中，用中和抗体阻断RAGE或用特异性siRNA沉默RAGE表达可减少促炎细胞因子的释放，并提高存活率。sRAGE作为RAGE的分泌型亚型，含有胞外结合域，但缺乏胞浆和跨膜结构域。重要的是，sRAGE可以通过与其配体的竞争性相互作用来消除RAGE介导的细胞信号转导。有报道表明，脓毒症患者的血浆sRAGE水平显著升高，而非存活者的sRAGE水平高于存活者。鉴于RAGE在疾病中的重要作用，阐明RAGE介导信号不仅有助于我们理解脓毒症发病机制的分子机制，而且有助于制定治疗策略。
RAGE的胞浆部分由43个氨基酸组成，不包含任何已知的细胞信号转导功能域或基序。先前的研究表明，缺乏胞内尾的RAGE突变体不能激活下游信号并诱导巨噬细胞释放促炎细胞因子，表明RAGE的胞质尾在将胞外信号转导到细胞中起着关键作用。
由于胞浆部分对RAGE介导的信号传导很重要，一些实验室已经尝试描述这种缺失的胞内区域。Ishihara等人报道，ERK1/2通过与位于RAGE39胞浆结构域的含D结构域的对接位点结合，直接与RAGE相关，但他们没有进一步研究ERK1/2在RAGE介导的信号激活中的作用。Hudson等人证明，mDia1与ctRAGE结合对于RAGE配体和刺激AKT磷酸化以及细胞增殖/迁移至关重要。尽管许多研究表明RAGE的胞浆尾部对RAGE配体诱导的细胞活化至关重要，但膜近端区域在信号传导中的作用仍不清楚。
在本研究中，我们使用T7噬菌体展示系统鉴定了衔接蛋白SLP76作为RAGE细胞溶质尾部的结合伙伴。作为造血细胞特异性衔接蛋白，SLP76在血小板、肥大细胞和中性粒细胞表面受体结合下游的多种信号通路中起调节作用。SLP76由四个关键结构组成：一个SH2结构域、一个富含脯氨酸的区域、一个SAM结构域和一个包含三个酪氨酸磷酸化位点的酸性结构域（人类中的Y113、Y128和Y145）。据报道，SLP76作为支架蛋白与Grap2、Vav1和Nck形成微团簇，随后被LAT招募到膜近端区域，整合T细胞激活信号。尽管SLP76在T细胞免疫中具有重要作用，但其在巨噬细胞中的表达和功能尚不清楚。
为了确定RAGE细胞溶质尾部与SLP76结合的功能区，我们制备了各种RAGE突变体转染HEK293细胞，发现DCT区而不是D域对接位点是介导RAGE与SLP76相互作用的关键结构（图2b）。生物信息学分析表明，RAGE的胞浆尾部含有4个潜在的磷酸化位点（Y391、Y399、Y400和T401）。为了阐明这些磷酸化位点是否对RAGE介导的信号传导起关键作用，我们构建了相应的磷酸化位点突变体，发现这些磷酸化位点的突变对AGEs诱导的信号传导过程没有显著影响（补充图6）。
为了寻找与RAGE结合的SLP76的特异性结构域，产生了不同的SLP76突变体，用于过表达和免疫沉淀。有趣的是，SAM结构域对于SLP76与RAGE的胞浆尾部的相互作用（图2c）以及随后的AGE诱导的信号转导（图4h）是必不可少的。对SAM结构域附近酪氨酸位点突变体的进一步实验表明，这些磷酸化位点（Y113、Y128和Y145）不会显著影响巨噬细胞中AGE诱导的信号通路激活（图4h），尽管Y113位点略微影响RAGE和SLP76之间的相互作用（图2c）。我们的研究结果支持了SLP76通过SAM结构域与RAGE的胞浆尾部结合介导下游信号转导的重要概念。具有高含量α-螺旋结构的SAM结构域存在于所有亚细胞室中，并参与多种细胞过程，包括信号转导、蛋白质-蛋白质相互作用、基因转录调控和蛋白质翻译控制。考虑到SLP76的SAM结构域在RAGE介导的信号传导中不可或缺的作用，靶向SAM结构域可能为RAGE过度激活引起的疾病提供一种治疗策略。
HMGB1作为RAGE的体内配体，在脓毒症的炎症反应中起重要作用。败血症患者的循环HMGB1水平持续升高，与住院死亡率相关；此外，给予CLP小鼠抗HMGB1中和抗体可提高存活率。因此，在脓毒症中抑制RAGE的有益效果至少部分归因于其配体HMGB1的抑制。在CLP小鼠模型中，AGEs和HMGB1在血液中的浓度动态不同；AGEs在败血症早期增加，在CLP后3小时达到峰值，而HMGB1随着时间的推移在血液中积累（图6b，c）。
为了评估靶向SLP76的潜在临床应用，我们使用CPP将SAM结构域传递到细胞中，通过竞争性阻断内源性SLP76与RAGE胞浆尾部的结合来阻断SLP76与RAGE的相互作用。正如预期的那样，TAT-SAM合成肽预处理显著抑制AGE诱导的信号通路激活，导致巨噬细胞中促炎介质的产生减少。此外，CLP后1小时通过尾静脉注射给小鼠TAT-SAM肽不仅抑制细胞因子释放，而且降低血液中HMGB1的浓度（图6f），因此，组织损伤显著减少，小鼠存活时间延长（图6）。
基于以上发现，我们得出结论：RAGE与其配体的相互作用将SLP76招募到RAGE的胞浆尾部，导致下游信号通路的快速激活，从而启动促炎介质的基因转录，包括TNF、IL-6、CXCL10、HMGB1等。上调的HMGB1与RAGE结合，触发并放大炎症反应。通过这种正反馈调节机制可以产生大量促炎因子，进而引起持续的炎症反应和严重的组织损伤，最终导致小鼠多器官衰竭和死亡（图7）。值得注意的是，RAGE的功能不仅仅局限于骨髓细胞和淋巴细胞，如缺乏SLP76表达的内皮细胞；另一方面，SLP76被认为是T细胞受体（TCR）的一个信号传导成分，作为一个支架蛋白来传递信号。所有这些研究表明，尽管RAGE和SLP76在骨髓细胞中存在结合伙伴关系，但RAGE和SLP76的功能也可以在其他细胞中独立发挥。
图7 SLP76在RAGE介导的脓毒症细胞内信号转导中的关键作用
脓毒症发作时，AGEs迅速释放并在血液中积聚。在AGEs与细胞表面受体RAGE结合后，SLP76作为衔接蛋白被招募到RAGE的胞浆尾部，将信号从膜传递到细胞中，导致p38 MAPK、Erk1/2和IKKα/β途径通过连续的蛋白质磷酸化快速激活。下游激酶的激活导致转录因子（TFs）如NF-κB的磷酸化，从而增强促炎介质（包括TNF、IL-6、CXCL10、HMGB1等）的基因转录。DAMP分子HMGB1作用于RAGE，启动第二波蛋白激酶级联激活，产生正反馈机制来维持和放大促炎症反应。促炎因子的过度产生导致组织损伤，最终导致小鼠多器官衰竭和死亡。
在本研究中，我们发现SLP76与RAGE的相互作用是由SAM结构域介导的，这不仅有助于理解RAGE介导的信号转导机制，而且为败血症的治疗提供了一个潜在的靶点。更具前瞻性的是，我们对RAGE信号的发现可能为理解其他RAGE相关疾病，如糖尿病、心血管疾病和神经退行性疾病打开了一扇窗口。
然而，我们的研究有一定的局限性。首先，SLP76配体复合物的组成尚未确定；因此，关于RAGE和下游激酶级联之间关系的知识空白尚未完全填补。其次，在本研究中，TAT-SAM对脓毒症的治疗作用仅在小鼠身上观察到；这种针对SLP76的SAM结构域的策略需要临床试验来评估其效果和安全性。通过综合努力，人们可以开发出一种治疗败血症的干预技术。