科研 | Cell Death Dis.：SOX1通过激活维生素A代谢途径促进鼻咽癌细胞分化（国人佳作）
编译：阿温，编辑：Emma、江舜尧。
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未分化是鼻咽癌(NPC)的一个主要特征，这是一个介入分化的独特治疗机会。在本研究中，我们发现SOX1能够抑制NPC细胞的增殖、促进细胞分化、诱导细胞衰老，这取决于其转录功能。RNA测序分析显示，在SOX1过表达的NPC细胞中，角蛋白家族的多个未分化标志物KRT5、KRT13、KRT19均降低。有趣的是， GO功能分析显示，过表达SOX1细胞中的基因在细胞外功能中富集。LC/MS非靶向代谢组学数据显示，过表达SOX1细胞和培养基中维生素A含量均高于对照组。随后，我们对视黄酸(RA)信号或代谢途径中的基因mRNA水平进行筛选，发现UDP-葡醛酸转移酶的表达明显降低。此外，UGT2B7可以挽救过表达SOX1诱导的分化。雷酚内酯(T-96)抑制UGTs可模拟SOX1促进NPC细胞分化。因此，我们描述了SOX1通过激活维生素A代谢途径调控NPC细胞分化的机制，为NPC分化治疗提供了潜在靶点。
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实验设计
实验结果
1. 过表达SOX1促进NPC细胞分化
为了确定NPC分化状态是否需要SOX1，我们利用Tet-ON系统在两个低分化的NPC细胞株(HONE1和CNE2)中稳定过表达SOX1。与未使用强力霉素的细胞相比，强力霉素(Dox)诱导SOX1表达。SOX1的诱导导致HONE1和CNE2细胞的形态学改变，其组织学特征为细长的纺锤形表型(图1a)。在过表达SOX1的HONE1和CNE2细胞中E-cadherin上调(图1b)。过表达SOX1减弱细胞增殖和克隆形成(图1c-e)。此外，过表达SOX1后，衰老相关的β-gal阳性细胞比例增加(图1f)。结果表明，SOX1促进NPC细胞的分化。
图1 过表达SOX1促进NPC细胞分化
2. SOX1促进NPC细胞分化依赖于它的转录功能
SOX1在NPC细胞分化过程中的作用机制仍不清楚。先前的研究表明，SOX家族成员不仅通过直接的转录调节作用来调控发育事件，还通过形成蛋白-蛋白相互作用以及作为共激活剂或共抑制剂来调控发育事件。为了揭示其机制，我们首先检测了HONE1和CNE2细胞中SOX1的表达，并发现SOX1定位于细胞核内(图2a)。然后制作两个截断的SOX1表达载体，即ΔHMG SOX1 (SOX1没有N端)和Δ246-391 SOX1 (SOX1没有C端)，连同全长SOX1表达载体(V5-标记SOX1)。将所有质粒分别在HONE1和CNE2细胞中转染。两个SOX1截断表达的NPC细胞的细胞形态和相关分化蛋白标记物与空载组相似。此外，两个SOX1截断表达没有诱导细胞衰老。这些数据表明，SOX1的HMG box和C端(转录激活域)的缺失显著降低了SOX1促进NPC细胞分化的能力。HMG box是与DNA结合的关键。SOX1的HMG box与其他SOX亚家族成员的同源性高度相似，尤其SOX2。因此，根据SOX2晶体结构判断SOX1的DNA结合位点中我们突变了两个氨基酸(Arg53为Asp, Asn78为Ala)(图2b)。免疫荧光染色检测突变体SOX1的表达仍局限于细胞核内(图2d)。突变型SOX1表达的NPC细胞的细胞形态和相关分化蛋白标记物与空载组相似(图2c, e)。此外，突变型SOX1的表达没有诱导细胞衰老(图2f)。数据表明，SOX1中HMG box的突变明显损害了SOX1促进NPC细胞分化的能力。综上所述，这些发现表明SOX1诱导NPC细胞的分化与其转录功能有关。
图2 HMG box是SOX1促进NPC细胞分化所不可缺少的。
3. SOX1诱导角蛋白的整体改变
虽然有文献报道角蛋白可以作为分化的指标，但尚未有系统研究角蛋白家族在分化和未分化鼻咽癌之间的变化。在这里,我们分析了GEO数据库42例癌组织和4例正常组织的RNA-Seq数据。在NPC组织中发现角蛋白整体高表达(图3a)。为了了解SOX1在NPC细胞中的表达是否会影响角蛋白的表达，我们对HONE1-TRE-SOX1和CNE2-TRE-SOX1加入或不加入强力霉素4天，然后进行RNA-Seq。结果表明，SOX1的诱导大大降低了角蛋白的表达(图3b)。通过RT-PCR和western blot检测角蛋白在mRNA和蛋白水平的表达(图3c, d)。结果显示SOX1降低了角蛋白KRT5、KRT13、KRT19的表达，与RNA-Seq数据的结果基本一致。因此，这些数据提示NPC中SOX1的低表达与角蛋白的高表达相关。GSEA显示，过表达SOX1后，基因富集在G2/M检查点、E2F靶点和有丝分裂纺锤体调控中(图3e)。此外，由于细胞分化通常需要G0/G1阻滞，且过表达SOX1后富集于E2F靶点，所以随后检测细胞周期分布。结果表明，SOX1诱导细胞周期G0/G1期阻滞，但不促进细胞凋亡。GSEA分析显示SOX1下调Myc靶基因，抑制mTOR1通路。SOX1可显著降低NPC细胞中c-Myc和mTOR1下游蛋白的表达。
图3 角蛋白基因家族中NPC细胞未分化标记物的筛选。
4. SOX1通过激活维生素A途径促进NPC细胞分化
HONE1-TRE-SOX1和CNE2-TRE-SOX1(Dox+)与相应对照组(Dox−)比较，RNA-Seq显示229个上调基因和95个下调基因(图4a)。分化细胞的GO分析显示，基因具有丰富的细胞外活性，提示分化细胞的细胞外成分可能与未分化细胞不同(图4b)。为了验证我们的假设，我们用从HONE1-TRE-SOX1细胞培养基(Dox+)中获得的CM处理HONE1细胞。令人惊讶的是，CM诱导KRT13和KRT19的改变(图4c)。然后使用LC-MS非靶向代谢组学分析在Dox处理和未处理HONE1-TRE-SOX1的细胞组成和CM的组成。结果表明，Dox处理后，CM和细胞中维生素A含量均增加(图4d, e)。为了确定细胞分化是否是由于维生素A水平升高，NPC细胞用维生素A醋酸酯(RAce)处理并检测其蛋白水平。KRT5和KRT13的表达明显降低，说明维生素A代谢通路参与NPC细胞分化(图4f)。此外，RA/RAce显著抑制NPC细胞的克隆形成和细胞活力(图4g, h)。这些数据表明，SOX1通过激活维生素A通路促进NPC细胞分化。
图4 LC/ MS非靶向代谢组学揭示了在SOX1过表达细胞中维生素A通路的富集。
5. UGT2B7破坏SOX1促进NPC细胞分化
我们的数据显示，在分化的NPC细胞中，维生素A的含量由于SOX1过表达而增加。绘制维生素A信号转导图和代谢图，以表示维生素A如何转运到细胞并转化为RA(图5a, c)。细胞中RA的含量是由众多参与类维生素A代谢的酶紧密控制的。因此，我们研究了SOX1增加NPC细胞中RA积累的机制。RT-PCR检测RA信号通路相关酶或受体的表达：由视黄酸6 (STRA6)、细胞视黄酸结合蛋白1 (CRABP1)、细胞视黄酸结合蛋白2 (CRABP2)、RARs (RARA, RARB, RARG)和RXRs (RXRA, RXRB, RXRG)刺激的RA诱导基因。此外，还检测到卵磷脂视黄醇酰基转移酶(LRAT)、细胞色素P450家族26亚家族(CYP26A1、CYP26B1、CYP26C1)和UDP葡萄糖醛酸转移酶家族(UGT1A (total)、UGT1A1、UGT1A6、UGT1A9、UGT2B7、UGT8)基因(图5b, d)。数据显示，SOX1抑制了一些UGT基因的表达，包括UGT1A6和UGT2B7 (图5d)。然后，双荧光素酶报告基因检测结果显示，SOX1不影响UGT1A6或UGT2B7启动子的转录活性。我们继续在SOX1异位表达的细胞中过表达UGT1A6或UGT2B7，发现UGT2B7而不是UGT1A6可以部分挽救SOX1诱导的NPC细胞分化的能力(图5e-g)。这些数据表明，UGT2B7可能是SOX1的靶点。然而，SOX1调控的RA代谢网络是由多种因素协调平衡的，而不仅仅是UGT2B7。
UGTs 葡萄糖醛酸化RA并破坏其生物活性。SOX1可能通过降低UGTs的表达来阻止RA的葡萄糖醛酸化，最终导致RA在细胞中积累，促进分化。然后，用UGT1A6和UGT2B7的抑制剂T-96处理HONE1和CNE2细胞，细胞形态分化(图6a)。Western blot也显示，相关的分化标记物KRT5和KRT13均下降(图6b)。T-96还能抑制细胞增殖，诱导衰老(图6c, d)。因此，抑制UGTs导致NPC细胞分化。
图5 SOX1解除对NPC细胞中UGTs表达的调控而激活视黄酸通路
图6 靶向UGTs促进NPC细胞分化
结论
总的来说，我们发现SOX1通过解除UGTs表达的控制来增强类维生素A的积累，从而促进NPC分化。我们的数据为研究UGTs作为分化治疗靶点提供了令人信服的生物分子基础，并揭示了其抑制剂T-96在NPC治疗中的潜在应用(图6e)。