科研│中国林业科学研究院：核桃胚胎的转录组分析揭示了脂类生物合成和多不饱和脂肪酸代谢的关键发育阶段和相关基因（国人佳作）
编译：微科盟伊一，编辑：微科盟景行、江舜尧。
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核桃是一种广泛栽培的木本油料树种，其胚富含多不饱和脂肪酸。迄今为止，核桃胚胎发育过程中油脂生物合成的途径和必需基因仍不清楚。本研究分析表明，一个成熟的核桃胚积累了69%的油，其中71%是多不饱和脂肪酸，64%亚油酸和7%亚麻酸。在授粉后第49、63、77、91、105、119、133和147天收集的核桃胚胎制备的24个cDNA文库中，RNA测序产生39，384个单基因。样品的主成分分析和差异表达基因的聚类分析表明，总样品分为三个主要组:49DAP、63-119DAP和133-147DAP（DAP：授粉后几天）。研究者鉴定了108个与脂类生物合成相关的单基因，包括60个脂肪酸生物合成单基因，33个三酰甘油生物合成单基因，7个油体单基因，8个转录因子单基因。编码WRI1、ACCase、ACP、KASII、SAD、FAD2、FAD3和PDAT的基因的表达水平在63-119 DAP相对于49 DAP的水平上调。此外，核桃胚的脂肪生物合成开始增加，而含油量从15%增加到69%。研究者鉴定了八个SAD，三个FAD2，一个FAD3，一个FAD5，一个FAD6和三个FAD7/8基因。此外，SAD、FAD2和FAD3在核桃胚中大量表达，其FPKM值分别为834、2205和9038。FAD2和FAD3的高表达水平可能是核桃富含多不饱和脂肪酸的原因。亚细胞定位证实JrFAD3蛋白在内质网而不是质体中起作用，表明亚麻酸主要在内质网中合成。加权基因共表达网络分析显示ACP、ENO、VAMP727和IDD14与WRI1共表达。本研究为核桃胚胎发育提供了大规模、全面的转录组数据。这些数据为核桃的代谢工程增加油脂含量和改变脂肪酸组成奠定了基础。
论文ID
原名：Transcriptome Analysis of Walnut (Juglans regia L.) Embryos Reveals Key Developmental Stages and Genes Involved in Lipid Biosynthesis and Polyunsaturated Fatty Acid Metabolism
译名：核桃胚胎的转录组分析揭示了脂类生物合成和多不饱和脂肪酸代谢的关键发育阶段和相关基因
期刊：Journal of Agricultural and Food Chemistry
IF：4.192
发表时间：2020年12月
通讯作者：裴东
通讯作者单位：中国林业科学研究院林业研究所
DOI号：10.1021/acs.jafc.0c05598
实验设计
结果和讨论
1 形态特征和油脂
核桃胚胎在授粉49至147天之间发育(图1A)，随着胚胎的发育，含油量从不到15%增加到69%以上(图1B)。在果核硬化阶段(49 DAP)，胚肉眼可见，直径小于5毫米。在油合成期(63-119 DAP)，胚直径增加到20毫米以上，子叶生长到充满整个种皮。此外，含油量从15.00%增加到69.10%，每个坚果的干胚重从0.25克增加到6.75克。在果实成熟时(133-147 DAP)，胚直径略有增加，含油量约为69%。
图1C显示了授粉63-147天后，核桃油的脂肪酸组成。在63-147 DAP时，亚油酸始终是含量最高的脂肪酸，花生酸和二十碳烯酸的含量保持在相对较低的水平(< 3%)，棕榈酸含量从17.63下降到6.47%，油酸含量从6.75上升到19.32%，亚麻酸含量从12.17下降到6.94%，不饱和脂肪酸从80.94上升到90.91%。本研究数据表明，成熟核桃胚的含油量为69%，90%以上的油是不饱和脂肪酸(即64.47%亚油酸、19.32%油酸和6.94%亚麻酸)，不到10%的油是饱和脂肪酸(即6.47%棕榈酸、2.56%硬脂酸和0.06%花生酸)。成熟核桃胚的干重约为7.78克，含有3.50克亚油酸、1.05克油酸和0.24克亚麻酸(图1D)。亚麻酸在91DAP时积累速率最高，其他脂肪酸在105DAP时积累速率最高。
2 转录组测序和基因表达谱聚类
对采集自8个胚胎发育阶段的核桃胚胎的24个文库进行了测序。总共获得了12.8亿个碱基对，每个样本平均有53 134 592个原始读数和51 944 148个干净读数。干净读取与原始读取的平均比率为95.62%(表S2)。干净读数在NCBI可以免费阅读(登记号:PRJNA643637)。
从转录组数据中共鉴定出39 384个unigenes。基于RNA-seq FPKM对所有24个样本进行主成分分析，发现两个主成分解释了37.6%的总方差(PC1和PC2分别为22.3%和15.3%)。在同一时间点采集的三个样本非常接近，这表明三个生物复制品之间有很高的一致性(图2A)。通过对每个时间点的样本进行成对比较，共识别出6890个DEG(图2B)。图2C给出了基于平均FPKM的聚类分析。结果表明，49DAP和133-147 DAP的高表达基因较多。将24个样品分成三个主要组:第一阶段(49个DAP)的样品组成一组，中间五个阶段(63、77、91、105和119个DAP)的样品组成第二组，最后两个阶段(133和147个DAP)组成第三组。这三组分别对应核桃果实发育的果核硬化期、油脂合成期和成熟期。
图1.核桃胚发育过程中的形态特征和油脂:(A)授粉后49-147天的形态特征；（B）63-147天时的干胚重量和含油量；（C）在63-147道尔顿时脂肪酸组成的变化；（D）脂肪酸含量和积累速率。
图2.样本的主成分分析和数据包络分析的聚类分析:(A)所有24个样本的主成分分析都是基于RNA-序列FPKM进行的。(B)每个时间点样本之间的成对比较。我们在表S3中确定了总共6890个DEG。(C)基于平均FPKM的DEGs聚类分析。色标(-2至2)代表计算的Z分数。
3 差异表达基因趋势分析
为了进一步阐明核桃胚胎发育的机制，研究者重点研究了胚胎发育的趋势。转录组的变化通过加权基因共表达网络分析进行检测，该分析将基因分为六个模块(图3A)。每个模块中列出了每个模块的DEG和KEGG路径的数量。最大的模块(绿松石)包含3606个DEGs，在49 DAP时表达最高，包括与核糖体、氨基酸生物合成、次生代谢物生物合成和氧化磷酸化相关的基因。第二大模块(蓝色)包含1758个DEGs，在147 DAP时表达最高，包括与碳代谢、乙醛酸和二羧酸代谢、MAPK信号通路和内质网中蛋白质加工相关的基因。此外，棕色模块包含515个DEGs，其表达在49-91 DAP下调，在105-147 DAP上调，包括与RNA转运、真核生物中核糖体生物发生和剪接体相关的基因。黄色模块包含380个在63个DAP时表达最高的DEGs，其包括与糖酵解、脂肪酸生物合成、碳代谢和氨基酸生物合成相关的基因。同样，红色模块包含121个在77-119 DAP高表达的DEGs，包括与脂肪酸代谢、光合作用、类黄酮生物合成和不饱和脂肪酸生物合成相关的基因。
为了更好地理解模块的基因表达模式和生理特征之间的关系，研究这使用WGCNA进行了关联分析(图3B)。所有脂肪酸的积累速率与红色模块高度相关，含油量与绿色模块高度相关。结合KEGG途径和模块-性状相关分析，黄色、红色和绿色模块与脂肪酸生物合成相关。
图3.RNA-seq和生理性状数据的WGCNA:(A)WGCNA由24个样本计算，6890个DEG分为6个模块。列表示平均值的模块特征基因。列出了每个模块的deg和KEGG途径的数量；(B)图1中模块的表达模式与取样日期和生理性状相关。每个彩色框中的数字给出了相关系数的值。
表1 .核桃胚胎发育过程中脂质相关基因的鉴定。
4 脂类生物合成相关基因的鉴定
在这项研究中，研究者重点关注在油脂合成中起关键作用的基因。图4显示了核桃胚中脂类生物合成的模型。研究者鉴定了108个与脂类生物合成相关的unigenes，包括60个脂肪酸生物合成，33个三酰甘油生物合成，7个油体，8个转录因子。在108个unigenes中，17个属于黄色模块，14个属于绿松石模块，14个属于其他模块。大多数参与脂肪酸合成的基因在49-119DAP磷酸腺苷高度大量表达(表1)。在转录组数据中，一些基因如ACP、SAD、FAD2、FAD3、油质蛋白和caleosin的FPKM值大于1000,这些高表达基因可能在核桃脂类合成中起重要作用。
图4.核桃胚胎发育过程中脂类生物合成的转录模型。基因的描述列于表1。每个水平行中的八个正方形对应于八个阶段(49、63、77、91、105、119、133和147 DAP)。灰色平方平均FPKM = 0。G-3-P，甘油3-P；LPA，1-酰基甘油-3P；1，2-二酰基甘油-3P；DAG，1，2-二酰基甘油；和TAG，三酰甘油。
图5. 脂质生物合成相关基因的非分类表达模式。 符号表示平均FPK M值，短竖线表示SE。 在x轴上的测量单位是DAP。
表2. 脂肪酸去饱和的单基因鉴定。
5 质体脂肪酸生物合成相关基因
丙酮酸脱氢酶复合体(PDHC)由四个亚单位(即E1α、E 1β、E2和E3)组成，是一组限速酶，催化丙酮酸不可逆氧化脱羧生成乙酰辅酶a。图5A显示编码三个亚单位(即E1α、E 1β和E2)的基因在49-119 DAP高度表达。高度活跃的PDHC为脂质合成提供了前体。
乙酰辅酶a羧化酶(ACCase)催化脂肪酸合成的第一步，是脂质合成的限速酶。ACCase由以下亚单位组成:生物素羧化酶(BC)、生物素羧基载体蛋白(BCCP)和α-羧基转移酶(CTα)。本研究分析显示，编码这两个亚单位(即BCCP和CTα)的基因在49-119 DAP高度表达，在49-119 DAP低表达(图5B)，这可能部分解释了为什么含油量从15.00% (63DAP)增加到69.10% (119DAP)。
质体中有三种KAS催化不同碳链的合成。KASIII催化最初的缩合反应，催化乙酰辅酶a和丙二酰-ACP的结合形成4:0-ACP。KASI负责催化6至16个碳的碳链合成，KASII催化16:0-ACP至18:0-ACP的合成。本研究数据表明，KASII和KASI的表达呈现协调的时间模式，在49-119 DAP观察到高表达水平(图5C)。然而，KASII在比KASIII和KASI低得多的水平上表达，并且在63-119 DAP上大量表达，并且在63-119 DAP中大量表达，这可以部分解释为什么棕榈酸(16:0)含量从17.63% (63DAP)下降到5.86% (119DAP)。KASI-III表达水平的变化与碳链合成的顺序一致。
FATA和脂肪酸脂是两种类型的脂肪，具有碳链长度的特异性，它们的活性影响脂肪酸的组成。脂肪酸脂是一种对18:1-ACP特异的酰基特异性硫酯酶，脂肪酸脂主要水解饱和酰基-ACP。图5D显示49-119 DAP的脂肪酸脂的表达水平高于133-147 DAP。FATA表达水平比脂肪酸脂高得多，有利于不饱和脂肪酸的积累。
6 内质网中与三酰甘油和油体相关的基因
二酰基甘油酰基转移酶(DGAT)催化sn-甘油-3-磷酸(G3P)产生TAG，这可能是油脂积累的关键步骤。
除此之外，磷脂:二酰基甘油酰基转移酶(PDAT)是另一种合成TAG的途径。其功能是将磷脂酰胆碱的脂肪酸转移到二酚甘油中，产生溶血磷脂酰胆碱和TAG。图5E显示DGAT1和DGAT2的表达呈现协调的时间模式，在147 DAP表达最丰富。PDAT在比DGAT1和DGAT2高得多的水平上表达，并且在63-133 DAP上大量表达。以往的研究表明，PDAT的高表达有利于多不饱和脂肪酸的积累。
种子中的标签最终以油体的形式储存，油体由磷脂和一些蛋白质(即油质蛋白、钙蛋白和固醇蛋白)结合而成。Ding等的亚细胞定位实验表明，这三种蛋白定位于内质网和油体中。在本研究中，油质蛋白、钙蛋白和固醇蛋白分别由3、5和2个单基因编码(图4)。油质蛋白的表达水平比卡莱菌素和固醇蛋白高得多(图5F)。这三个基因在核桃胚中的表达水平在63-147DAP时均高于49DAP时，这与含油率的变化相一致。
表3. 脂类合成转录因子的鉴定。
7 不饱和脂肪酸相关基因
核桃油90%以上由不饱和脂肪酸组成，脂肪酸去饱和酶是控制不饱和脂肪酸类型和含量的关键酶。在这项研究中，在核桃中共鉴定出17个FAD，包括8个SAD、3个FAD2、1个FAD3、1个FAD5、1个FAD6和3个FAD7/8基因(表2)。在这17个FADs中，8、1、4和4个基因分别属于δ9去饱和酶亚家族、δ7去饱和酶亚家族、ω-6/δ12去饱和酶亚家族和ω-3/δ15去饱和酶亚家族(图6A)。核桃仁中只有一个FAD5基因，其表达非常低，这可能是核桃油中未检测到16:1脂肪酸的原因。
FAD6和FAD7/8低表达，而SAD、FAD2和FAD3在发育中的核桃胚中高表达。SAD (Jr16G11232、Jr01G12233和Jr02G10993)、FAD2 (Jr13G11197和Jr09G11115)和FAD3 (Loc109002248)基因高表达(FPKM > 100)(表2)，可能对核桃胚胎发育过程中不饱和脂肪酸含量有重要影响。表达热图显示SAD (Jr01G12233)、FAD 2(Jr13g 1197)和FAD3 (Jr13G11850)被归入一个类别，在49-119 DAP观察到高表达水平(图6B)。此外，SAD (Jr01G12233)和FAD2基因(Jr13G11197)在119 DAP表达最高，FPKM分别为377.66和1994.40(表2)。FAD3基因(Jr13G11850)的表达水平比SAD和FAD2高得多(图5G)，在91 DAP时表达最高(FPKM值为9037.79)。研究者推测核桃胚胎中的亚麻酸主要由内质网中的FAD3产生，而不是由质体中的FAD7/8产生(图6C)。
虽然核桃、山核桃，还有美洲山核桃都属于胡桃科，它们的胚芽油中有不同的脂肪酸组成。核桃油主要由亚油酸组成，而山核桃油和山核桃油主要由油酸组成(~70%)。核桃油的多不饱和脂肪酸(~71%)浓度高于美洲山核桃(~20%)和山核桃(~24%)油。
在美洲山核桃和山核桃胚的转录组数据中，SAD基因的表达高于AD2，而腺苷二磷酸酶基因的表达高于腺苷三磷酸酶基因。张等报道了高SAD和低FAD2的组合有利于山核桃中单不饱和酸的积累。因此，核桃中FAD2和FAD3的高表达是核桃油富含多不饱和脂肪酸的原因。
在以亚麻酸为主要脂肪酸的牡丹种子中，FAD3的表达水平高于FAD2，导致亚麻酸含量高于亚油酸含量。但FAD3在核桃胚中的表达水平高于FAD2，C18:3含量低于C18:2的原因有待进一步研究。这可能是由于翻译成蛋白质的核糖核酸的数量和蛋白质的催化效率不同。也可能是因为核桃中PDAT的高表达有利于亚油酸的积累。
8 JrFAD3的亚细胞定位
FAD2-和FAD 3介导的去饱和发生在内质网中，FAD6-和FAD7/8介导的去饱和发生在质体中。在之前的一项研究中，赵等人发现FAD7很可能是核桃仁中合成亚麻酸的关键酶。但刘等人发现，在核桃胚胎发育过程中明显过表达的FAD基因应该是JrFAD3。
值得注意的是，系统发育分析表明JrFAD3与AtFAD3和AtFAD7/8相似(图6A)，因此可能存在JrFAD3与JrFAD7/8的错误识别。为了进一步验证JrFAD3在细胞中的蛋白质定位，对该基因进行了亚细胞定位。
在本实验中，JrFAD3与表达载体pBWA(V)HS-GFP相连。如图7A所示，通过消化、聚合酶链反应扩增和电泳成功构建了pBWA(V)HS-JrFAD3-GFP。表达载体pBWA(V)HS-JrFAD3-GLosgfp(图7B)和对照载体pBWA (V) HS-GFP被转化到烟叶中进行瞬时表达。绿色荧光蛋白荧光为绿色，叶绿体标记荧光为红色，如图7C所示。结果表明，pBWA(V)HS-JrFAD3-GLosgfp融合蛋白的荧光仅集中在内质网中，而pBWA(V)HS-GFP的荧光分布在整个细胞中，表明JrFAD3蛋白位于内质网中。亚细胞定位证实JrFAD3蛋白在内质网中起作用，而不是在质体中起作用，这与以前的推测一致，表明核桃油中的亚麻酸主要在内质网中合成。
9 糖酵解为脂类合成提供了前体
光合器官产生的糖被运输到胚胎，依靠糖酵解为脂肪酸合成提供底物和能量。糖酵解可分为质体糖酵解和细胞溶质糖酵解。通过转运蛋白，如葡萄糖转运蛋白(GLT)，细胞溶质糖酵解的产物可以进入质体。己糖激酶(HXK)、磷酸果糖激酶(PFK)和丙酮酸激酶(PKP)是糖酵解整个过程中的三种限速酶。图8显示了核桃胚胎糖酵解的模型。研究者鉴定了155个与糖酵解相关的基因(表S4)，包括102个胞质糖酵解基因，15个转运蛋白基因和38个质体糖酵解基因。在102个胞质糖酵解基因中，17个属于绿松石模块，6个属于黄色模块，6个属于其他模块。在38个质体糖酵解基因中，7个属于绿松石模块，12个属于黄色模块。质体中的HXK和PFK在49-119 DAP高表达，在113-147 DAP低表达。醇溶蛋白(ENO)、PKP和珠蛋白质体的变化趋势与油溶蛋白相似。因此，质体糖酵解比胞质糖酵解更与脂质合成有关。
10 与脂质合成相关的转录因子
转录因子在植物生长发育中起着重要的调节作用。在6890个基因中，有443个基因属于转录因子(图9A)。绿松石、棕色、黄色、红色、绿色和蓝色模块中分别有215、28、24、6、16和144个转录因子。21个bHLH、11个bZIP、15个C2H2、18个ERF、13个GRAS和13个HD-ZIP家族转录因子在绿松石模块中，它们可能与胚胎发育有关。此外，31个ERF、13个MYB和13个NAC家族转录因子位于蓝色模块中，它们可能与胚胎成熟有关。
一些转录因子(即LEC1、LEC2、ABI3和FUS3)在种子发育和脂质合成中起关键作用(图9B)。表3显示了LEC1和US3的表达水平，它们是种子发育所必需的，在49-77 DAP时都比在91-147 DAP时高。AB3的表达对种子成熟至关重要，在91 DAP大量表达至最高水平。LEC2转录物表达较低，仅在49 DAP和91 DAP表达(表3)，表明该转录因子在核桃油积累过程中缺乏重要性。WRI1直接调节糖酵解和脂肪酸代谢的基因，在63-119 DAP大量表达。WRI1的表达模式与核桃油积累一致，可能在核桃油合成中起关键作用。
植物转录因子WRI1特异性正向调节糖酵解和脂肪酸合成过程，是油料作物遗传育种的重要靶基因。为了揭示WRI1的潜在机制，研究者构建了WGCNA共表达网络。如图9C所示，研究者根据基因与WRI1(Jr13G11524)的加权相关性对基因进行排序，并从黄色模块中选择前19个基因。在这些共表达的基因中，ACP (Jr02G10595)编码的蛋白质是脂肪酸生物合成中生长的脂肪酸链的载体，ENO (Jr15G10962)编码糖酵解中质体定位的磷酸烯醇式丙酮酸烯醇酶。囊泡相关膜蛋白727 (VAMP727，Jr13G11460)编码突触融合蛋白样蛋白家族的一员，这是将储存蛋白转运到蛋白储存液泡所必需的。值得注意的是，不确定结构域14(IDD14，Jr07G12104)是C2H2家族的转录因子，也是调节淀粉代谢的竞争性抑制剂。可降低Qua-Quine Starch(QQS)基因启动子的结合活性，抑制淀粉积累。上调WRI1和IDD基因的表达有利于核桃胚糖酵解产物中脂类的合成，而不是淀粉的合成。
11 脂质相关基因的qPCR反应分析
利用qPCR技术对12个与脂类生物合成相关的关键基因进行了评估。图10显示了与不饱和脂肪酸生物合成相关的三个基因的表达谱。D-F图显示了与油体相关的三个基因的表达谱，G-L图显示了与含油量相关的六个基因的表达谱。图版M显示RNA-seq和qPCR数据高度相关(R2= 0.80，p < 0.01)，表明RNA-Seq获得的表达数据是可靠的。
结论
综上所述，一个成熟的核桃胚积累了~69%的油，其中90.91%是不饱和脂肪酸，亚油酸为64.47%，油酸为19.32%，亚麻酸为6.94%。转录组分析表明，核桃胚的含油量和脂质组成与脂质生物合成基因的特异性表达有关。在63-119DAP时，编码WRI1、ACCase、ACP、KASII、SAD、FAD2、FAD3和PDAT的基因的表达水平相对于49DAP时的水平上调。此外，核桃胚的脂肪生物合成迅速增加，含油量从15%增加到69%。KASII表达的增加有助于从棕榈酸(C16:0)到硬脂酸(C18:0)的合成。
SAD、FAD2和FAD3的高表达水平有助于油酸(C18:1)、亚油酸(C18:2)和亚麻酸(C18:3)的积累。核桃中D2和FAD3的表达水平高于SAD，FAD2和FAD3基因的高表达水平可能是核桃富含多不饱和脂肪酸的原因。亚细胞定位证实JrFAD3蛋白在内质网而不是质体中起作用，表明亚麻酸主要在内质网中合成。在113-147 DAP，大多数与脂类生物合成相关的基因表达显著下调，含油量保持相对稳定，坚果进入成熟期。WGCNA显示ACP、ENO、VAMP727和IDD14与WRI1共表达，可能也促进脂质合成。通过比较前人对核桃胚的研究，发现编码KASIII、KASI、FATA、FATB、SAD、FAD2和FAD3基因的表达谱是一致的，这些基因在不同核桃品种中表现出相似的表达趋势，可能与核桃胚的发育有关。本研究为核桃胚胎发育提供了大规模、全面的转录组数据，qPCR分析证实了RNA-Seq获得的表达数据是可靠的。这些数据可为核桃的代谢工程提供增加含油量和改变脂肪酸组成的依据。
1 科研│FOOD CHEM（IF：6.306）：代谢和转录组联合分析枣树叶芽和成熟叶间代谢产物动态变化（国人佳作）
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