编译：Mr. Left，编辑：夏甘草、江舜尧。
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导读
高浓度地面臭氧（O3）和缺水影响森林生态系统服务。以前发现细胞间CO2浓度和异戊二烯排放受O3和干旱的复合影响，但控制这些表型的分子机制仍是未解决的问题。在本研究中，作者研究了O3敏感杂交品种杨树暴露于两个O3水平[活性炭过滤的环境空气（CF）和未过滤的环境空气加40 ppb（NF40）]和两种水分条件[充分灌水（W）和中度干旱（D）]时气孔导度（gs）和转录组的变化。NF40在D下比W减少更多的gs。作者从成对比较中鉴定了差异表达基因（DEG），发现杨树的干旱分子响应被升高的O3抵消了。从通过K均值聚类获得的9个聚类中，鉴定出12个核心转录因子。参与异戊二烯生物合成和植物激素信号通路的DEG表明，在O3和/或干旱条件下，杨树的分子响应和气孔关闭可能是通过MEP/DOXP和ABA依赖性途径。此外，有102个捕获DEG的Helitron参与了对O3和/或干旱的响应，并与ABA依赖性途径有关。这种综合分析提供了多维的见解，以了解对O3和干旱复合胁迫的分子响应。
原名：Molecular response of poplar to single and combined ozone and drought
译名：杨树对单一和复合臭氧与干旱的分子响应
期刊：Science of The Total Environment
IF：5.033
发表时间：2019.3
通讯作者：胡建军，冯兆忠
通讯作者单位：中国林业科学研究院林业研究所，中国科学院生态环境研究中心
DOI号：https://doi.org/10.1016/j.scitotenv.2018.11.195
1 RNA-seq数据的全转录组分析
为了揭示杨树在O3和干旱胁迫下的分子响应，作者比较了四种条件下杨树叶片的转录组变化。RNA-seq在每个重复产生42.6至5140万个配对原始片段，在修整和质量过滤后，至少保留97.6％或更多的高质量片段（表S1）。根据它们的转录本谱，在成对相关分析中将每个处理的重复聚在一起（图S1A）。在层次聚类中，样本“NF40_W”与“CF_W”紧密分为一组，而“CF_D”和“NF40_D”与“CF_W”不同（图S1B）。如图1A所示，在成对比较中鉴定出DEG。与“CF_W”对照相比，在“NF40_W”中识别出93个DEG（53个上调和40个下调），在“CF_D”中识别出2560个DEG（959个上调和1601个下调）。相反，与“CF_D/CF_W”相比，“NF40_D/CF_W”（即NF40_D与CF_W）中的DEG数量被显著减少至977个（311上调和666下调）。DEG在胡杨染色体上的分布表明，在干旱和/或O3胁迫下，这些DEG并未富集在特定的染色体区域中（图1A）。然后，作者比较了不同比较之间重叠的DEG。例如，“CF_D/CF_W”和“NF40_D/CF_W”之间有773个DEG重叠（217个上调和556个下调，图1B子集b），并且重叠的DEG在“NF40_D/CF_W”中占很大比例，而在“CF_D/CF_W”中占一小部分（图1B的子集a）。“NF40_W/CF_W”与其他比较（“NF40_D/CF_W”，“CF_D/CF_W”和“NF40_D/CF_D”）显示出显著差异：只有11个DEG与“NF40_D/CF_W”重叠（5个上调和6个下调），14个DEG与“CF_D/CF_W”重叠（5个上调和9个下调），而15个DEG与“NF40_D/CF_D”重叠（7个上调和8个下调）（图1B子集e）。为了评估在三种胁迫条件下的分子响应，比较了三个比较组“CF_D/CF_W”，“NF40_W/CF_W”和“NF40_D/CF_W”中的DEG，仅有两个上调的DEG（Potri.004G135500和Potri.012G128100）和四个下调的DEG（Potri.006G020000，Potri.006G239700，Potri.008G183200和Potri.009G148900）在三个比较组中共同存在（图1B子集p）。此外，比较了“CF_D/CF_W”和“NF40_D/NF40_W”，以评估复合胁迫下的干旱效应；在CF和NF40处理下，重叠的630个DEG（206个上调和424个下调）是核心的干旱响应基因（图1B子集r）。
图1 干旱，臭氧及其复合处理对基因表达的影响概述。（A）成对比较在两个O3水平下[活性炭过滤的环境空气（CF）和非过滤的环境空气加40 ppb（NF40）]和两个水分条件[充分灌水（W）和中度干旱（D）]下在成对比较[（1）“CF_D/CF_W”，（2）“NF40_D/CF_W”，（3）“NF40_W/CF_W”，（4）“NF40_D/CF40_D”，（5）“NF40_D/NF40_W”和（6）“NF40_W/CF_D”]中获得的19个杨树染色体上的差异表达基因（DEG）的分布。（B）不同比较组中的DEG重叠。确定了来自不同比较组的子集a-v，以供进一步研究。（C）（B）中不同子集中DEG的基因本体（GO）富集分析。在热图中可视化了用于GO富集的FDR的层次聚类。表S2中列出了GO术语的详细信息。
2 DEG的功能分类
为了理解DEG在不同子集中的功能差异（图1B），进行了GO富集分析。在子集b，f和o中，富集的下调-DEG的GO术语显示出相似的模式，主要被富集在“细胞胺代谢”，“有机酸生物合成”，“细胞氨基酸生物合成”和“基于微管”的过程。子集b，c，f，g，j，n，o和q中的上调-DEG在“初级代谢”，“翻译”，“基因表达”和“大分子生物合成”过程中具有相似的GO富集（图1C和表S2）。
为了进一步揭示DEG在杨树对O3和/或干旱的响应过程中的潜在功能，根据MapMan功能分类系统对DEG进行了分类（图S2，图S3）。所有的DEG都被分为35个类别。如图S2A所示，大多数DEG被归类为“各种酶家族”，“RNA”，“蛋白质”，“信号转导”和“运输”MapMan bin。值得注意的是，“CF_D/CF_W”中的大多数DEG在植物暴露于高水平O3（“NF40_D/CF_W”）时得以恢复，尤其是“”脂质代谢“次级代谢”，“激素代谢”，“胁迫”和“信号转导”分类中的DEG。细胞应答和胁迫应答的概述（图S2B和C）显示，在“NF40_W/CF_W”中，细胞应答和胁迫应答中仅几个基因差异表达。
3 DEG的K-均值聚类
为了发现杨树对干旱和/或O3响应的分子机制，通过K-均值聚类方法对四种处理组合中的DEG进行了聚类。在总共9个聚类中，4个聚类（1、4、5和6）在“CF_D”和“NF40_D”中均显示出下调。在“CF_D”中，聚类5中的基因抑制比“NF40_D”中的抑制更强（图2A）。GO富集分析表明，聚类1中的基因参与了“小分子生物合成”，“脂质生物合成”，“羧酸生物合成”和“脂肪酸生物合成”过程。聚类4中的基因参与了“基于微管”，“核苷酸分解代谢”和“蛋白质聚合”的过程。而聚类5中的基因参与了“非生物刺激”和“光刺激”响应。3个聚类（7、8和9）在“CF_D”和“NF40_D”中均表现出上调，而聚类7和9在“CF_D”中的诱导作用强于“NF40_D”。聚类7中的基因参与“细胞形态建成”和“发育”过程，而聚类8中的基因参与“翻译”和“细胞生物合成”过程。有趣的是，聚类2和3中的基因仅在“CF_D”下被下调，聚类2中的基因被富集在“磷酸化”和“翻译后蛋白质修饰”（图2B）。对不同聚类中主要TF家族的分析表明，它们对O3或干旱作用具有不同的敏感性（图2C）。总体而言，TF在聚类2中有很强的代表性（33个TF，占DEG的9.5％），其中包括6个NAC（NAC017，NAC034，NAC036，NAC042，NAC083和NAC096），6个ERF（CRF4，ERF72等），3个GRAS（SCL14，SGR7和Potri.005G125800），3个MYB（MYB63，MYB111和Potri.009G042600），3个bHLH（BIN1，MYC2和Potri.004G029100）和3个WRKY（WRKY11，WRKY18和WRKY47）（表S3）。
图2 DEG的K均值聚类。（A）通过K-均值聚类方法确定了9个聚类。（B）在9个聚类中对DEG进行GO富集。（C）9个聚类中转录因子（TF）家族的热图分布。表S3中列出了9个聚类中TF的完整列表。
4 参与异戊二烯生物合成基因的差异表达
为了探索异戊二烯的排放变化是否与其生物合成有关，作者分析了参与异戊二烯生物合成中基因的表达谱。在植物中，异戊二烯通过甲羟戊酸（MVA）或非甲羟戊酸（MEP/DOXP）途径合成。在MVA途径中，两个编码羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶（NADPH，EC：1.1.1.34）的基因（Potri.004G208500和Potri.009G169900）在“CF_D”中被下调，在补充O3后恢复（“NF40_W”和“NF40_D”）。在MEP/DOXP途径中，编码1-脱氧-d-木酮糖-5-磷酸合酶（EC：2.2.1.7）的三个基因（Potri.006G249700，Potri.008G196500和Potri.010G015200）在“NF40_W”中被特异下调；在“CF_D”和“NF40_D”中编码2-c-甲基-d-赤藓糖醇2,4-环焦磷酸合成酶（EC：4.6.1.12）的两个基因（Potri.001G099300和Potri.003G132400）被下调；而编码4-羟-3-甲基丁-2-烯基二磷酸合酶（EC：1.17.7.1）的两个基因（Potri.004G210400和Potri.009G013400）在“CF_D”，“NF40_W”和“NF40_D”中被下调（图3）。
图3 参与异戊二烯生物合成途径中基因的表达模式。甲羟戊酸（MVA）途径和MEP/DOXP途径合成异戊二烯的关键酶编码基因的表达模式。颜色代表每个基因的log2倍数变化。
5 参与激素信号通路基因的差异表达
为了进一步确认植物激素参与杨树对干旱和/或O3的响应，作者随后分析了参与植物激素信号通路基因的概况，包括ABA，生长素，油菜素甾体（BRs），细胞分裂素（CTK），乙烯（Eth），赤霉素（GA），茉莉酸（JA）和水杨酸（SA）。参与ABA途径的基因在“CF_D”中被显著上调，在“NF40_D”中被恢复。相反，参与生长素途径的基因在“CF_D”中被下调，而在“NF40_W”和“NF40_D”中被恢复。在干旱条件下“GA_D”和“NF40_D”参与GA途径的基因被上调，但在“NF40_W”中被抑制。另外，参与JA和SA途径的基因在“CF_D”中被上调，而在“NF40_W”中被下调，在“NF40_D”中没有显著变化（图4）。
图4 当植物暴露于两种O3水平[活性炭过滤的环境空气（CF）和未过滤的环境空气加40 ppb（NF40）]和两种水分条件[充分灌水（W）和中度干旱（D）]时，参与不同激素信号途径基因的表达模式。分析的参与多种激素信号途径的基因包括脱落酸（ABA），生长素，油菜素甾体（BR），细胞分裂素（CTK），乙烯（Eth），赤霉素（GA），茉莉酸（JA）和水杨酸（SA）。
6 核心TF对干旱和/或O3的识别反应
基因表达由一系列TF调节。为了找出每个聚类中的主要TF，基于9个聚类中DEG的启动子序列分析了潜在的TF结合位点（TFBS）（图2A）。对于每个聚类，选择同一聚类中的TF作为优先调节物。TFBS扫描后，对应于19个TF家族共鉴定出186个TFBS，它们可能与九个聚类中DEG的启动子区域结合（表S4）。选择结合每个聚类中大多数DEG的主要TF进行进一步研究（图5）。例如，主要TF HB-1可以以“AATAATT”的核心序列与TFmatrixID_0471结合，而在聚类1中有75.2％（403个中的303个）基因启动子中提供了该元件。聚类1（TFmatrixID_0471，“AATAATT”）和聚类2（TFmatrixID_0288，“CATTAATT”）中最具代表性的TFBS共享部分相似的序列“TAAT”。聚类3、5和8中的主要TFBS具有相同的核心序列“GTC”，而聚类8中DEG的表达模式与聚类3和5中的不同。在最大的聚类（聚类7）中，包含ABF2结合位点TFmatrixID_0193的DEG占91％。
为了验证RNA-seq的准确性，使用qRT-PCR验证了来自9个聚类的12个主要TF（图5A）。12个TF的RNA-seq和qRT-PCR之间的相关指数（R2）为0.885至0.991，表明RNA-seq数据具有很高的准确性和可重复性（图5B）。
图5 核心TF及其结合位点（TFBS）识别。（A）每个聚类中最丰富的TFBS及其对应的TF。表S4中显示了全部DEG的TFBS的完整列表。（B）使用qRT-PCR在4种处理中使用qRT-PCR对12种选定的核心TF的表达验证，这些处理结合了两种O3水平[活性炭过滤的环境空气（CF）和未过滤的环境空气加40 ppb（NF40）]和两种水分条件[充分灌水（W）和中度干旱（D）]。12个核心TF的基因ID：HB1（Potri.015G065400），HDG2（Potri.014G152000），WRKY70（Potri.006G109100），CIB1a（Potri.004G156000），CIB1b（Potri.007G023600），CIB1b（Potri.009G117300），WRKY40（Potri.018G019700），WOX13（Potri.002G008800），ABF2（Potri.014G028200），NAC029（Potri.008G08900），RVE1（Potri.004G074300）和RVE7（Potri.012G038300）。
7 携带DEG的Helitron参与杨树的干旱/O3响应
使用HelitronScanner进行扫描后，共鉴定出102个捕获DEG的Helitron。Helitron捕获的DEG的表达模式如图6A所示。在杨树基因组中，102个Helitron不均匀地分布在19条染色体上（Chr，图6B）。21和24个Helitron的长度分别为14-16 kb和18-20 kb（图6C）。有趣的是，Helitron携带的DEG在与离子转运相关的过程中被显著富集（图S4）。此外，发现了Helitron捕获的8个差异表达的TF。如图6D所示，BLH6，Trihelix和MYB42分别被Helitron的hel_ptr_fwd_209，hel_ptr_fwd_282和hel_ptr_fwd_480捕获；而LOL1，HHO3，ARF16，GATA4和OZF2 / TZF3分别被Helitron hel_ptr_rev_021，hel_ptr_rev_343，hel_ptr_rev_357，hel_ptr_rev_358，hel_ptr_rev_564捕获（表S5）。HHO3属于聚类7（图2A），它可以与TFmatrixID_0327位点上同一聚类中44.4％的基因结合。聚类4中的另一个TF GATA4被hel_ptr_rev_358捕获，可以与TFmatrixID_0265位点上的56.6％的基因结合（表S4）。而且，参与ABA依赖性途径的两个DEG（HAI1和AZF3）分别被hel_ptr_fwd_050和hel_ptr_fwd_627捕获（表S5）。
8 DEG之间的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络
DEG的相似表达模式为其在蛋白质水平上进一步的物理相互作用提供了基础。然后，作者分析了不同处理下DEG之间的PPI关系。如图7A所示，在“CF_D/CF_W”和“NF40_D/CF_W”中由上调DEG编码的蛋白质比下调DEG具有更强的PPI关系。例如，来自“CF_D/CF_W”上调DEG的281种蛋白质之间有3039个PPI关系，来自“NF40_D/CF_W”上调DEG的108种蛋白质之间有2024个PPI关系。“CF_D/CF_W”和“NF40_D/CF_W”下调DEG的PPI网络中的蛋白质数目大于上调DEG的PPI网络中的蛋白质数目，而这种关系显著下降，在来自“CF_D/CF_W”和“NF40_D/CF_W”的407和155个下调DEG中，分别只有1198和345个PPI关系（表S6）。为了揭示这些相互作用蛋白的功能，作者进一步分析了它们富集的蛋白结构域（表S6）和GO术语（图7B和表S7）。根据蛋白质结构域，在“CF_D/CF_W”上调-PPI网络中富集了L-乳酸/苹果酸脱氢酶（IPR001557）蛋白和核糖体蛋白；微管蛋白结构域（IPR000217）蛋白被富集在“CF_D/CF_W”和“NF40_D/CF_W”下调-PPI网络中。此外，在“CF_D / CF_W”上调PPI网络中识别出7个Hsp或Hsf成员（2个Hsp90，4个Hsp70和1个Hsf），但是在“NF40_D/CF_W”上调PPI网络中仅识别了1个Hsp90和1个Hsp70（表S5）。根据GO类别，参与“翻译”的蛋白质在“CF_D/CF_W”上调PPI网络中被富集9.25倍，在“NF40_D/CF_W”上调PPI网络中被富集至18.87倍；与“苹果酸代谢过程”有关的蛋白质在“CF_D/CF_W”上调PPI网络中被富集了19.83倍，而“NF40_D/CF_W”上调PPI网络中没有术语被富集（图7B和表S7）。
9 臭氧和干旱影响杨树的生长和气孔导度
为了进一步确认臭氧与干旱的相互作用影响，作者比较了冠层中部的茎高，附着叶数和叶片gs。在CF和NF40的干旱胁迫下，杨树的垂直生长受到限制（图8A）。在CF条件下，干旱胁迫显著减少了附着叶片的数量。而当植物暴露于NF40时，W和D之间无显著差异（图8B）。在这四种处理中，O3和干旱复合处理的gs最低。在两个采样时间，即八月和九月，观察到了类似的趋势（图8C和D）。
图6 暴露在两个O3水平[活性炭过滤的环境空气（CF）和非过滤的环境空气加40 ppb（NF40）]和两个水分条件[充分灌水（W）和中度干旱（D）]下与杨树干旱和/或臭氧响应有关的捕获DEG的Helitron。（A）Helitron捕获的DEG的表达聚类。（B）在杨树基因组中19条染色体上的102个Helitron的分布。（C）102个Helitron的大小分布。（D）捕获TF的8个Helitron的结构。蓝色字母是Helitron的5'头部和3'尾部。
图7 响应于两个O3水平[活性炭过滤的环境空气（CF）和非过滤的环境空气加40 ppb（NF40）]和两个水分条件[充分灌水（W）和中度干旱（D）]，杨树中DEG的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络。（A）杨树对干旱和/或臭氧的响应中的DEG的PPI网络。表S6中显示了完整的基因列表及其在每个网络中的相互作用关系。表S7中列出了每个网络中基因的富集的蛋白质结构域。（B）参与PPI网络的基因的富集的GO生物学过程术语。表S8中显示了完整的富集的GO术语。
图8 臭氧和干旱对杨树生长和气孔导度（gs）的影响。在两个O3水平[活性炭过滤的环境空气（CF）和非过滤的环境空气加40 ppb（NF40）]和两个水分条件[充分灌水（W）和中度干旱（D）]下的株高（A），附着叶数（B）以及8月（C）和9月（D）的gs。棒表示平均值±SE（n ＝ 3）。Tukey’s HSD检验用于确定水分之间或臭氧处理之间的显著差异。不同的字母表示任一时间O3与水分处理之间的显著差异（P <0.05）。
gs对空气污染物的响应随物种，树叶和树木的年龄以及其他环境因素而变化。通常，短期暴露于高浓度O3下，气孔孔径会迅速减小，而在长期暴露下，气孔响应会减弱。在本研究中，高O3或干旱处理下，杨树的gs显著降低，而在复合处理（O3+干旱）下，gs进一步降低（图8）。在本研究中，不仅在生理方面，还通过RNA-seq检测了分子响应。值得注意的是，单一中度干旱诱导的DEG被高浓度O3有效地抵消了（图1）。在O3和/或干旱胁迫下，gs的变化趋势与DEG的变化趋势并不完全匹配，这可能是由于表型响应通常比基因表达水平延迟的事实，因为它们之间存在多个步骤，例如转录后调控，蛋白质水平，代谢产物水平等。在植物中，干旱胁迫将触发ABA的产生，然后导致气孔关闭并诱导胁迫响应基因的表达。随后，通过ABA介导的主动和/或水力介导的被动机制驱动的气孔关闭来确保节水。与单一处理“CF_D”相比，复合处理“NF40_D”下的gs更低，它将减少通过气孔减少水分流失。另外，在“CF_D”下ABA途径中的大多数上调DEG在复合处理“NF40_D”下被恢复（图4）。作者假设当植物暴露于高浓度O3时，干旱胁迫引起的ABA生物合成诱导可能受到气孔孔径限制的限制。高浓度O3及其产生的ROS（包括H2O2，OH和O2-）通过膜脂质的过氧化和变性作用对植物产生毒性。据报道，升高的O3会改变抗氧化剂的转录物和代谢产物。作者发现，充分灌水（-56％）时NF40处理下的异戊二烯排放量显著下降，但中度干旱（−25％）并未显著下降。有趣的是，MEP/DOXP途径的第一步，编码催化从d-甘油醛-3-磷酸到1-脱氧-d-木酮糖-5-磷酸的三个酶基因，仅在高浓度O3处理下才被下调（图3），这与之前观察到的异戊二烯排放趋势一致。在植物中，MVA和MEP/DOXP途径位于细胞的不同细胞器中，MEP/DOXP途径位于叶绿体中，MVA途径位于细胞质中。本研究结果表明，干旱缓解了高浓度O3条件下异戊二烯的排放下降，这主要归因于MEP/DOXP途径。胁迫响应基因表达的转录调控是植物非生物/生物胁迫响应的关键部分。大量的TF，例如ERF，bZIP，WRKY，MYB等，通过激活一定数量的胁迫响应基因在胁迫响应中起重要的调节作用。在已鉴定的核心TF中，WRKY70（聚类3）在“CF_D”下被下调，并在复合的“NF40_D”下恢复到对照水平（图5）。作为III类WRKY TF，WRKY70被公认为是植物防御的正调节剂和SA生物合成和衰老的负调节剂。在拟南芥中，干旱胁迫下，WRKY70和WRKY54作为气孔关闭的负调节剂，然后通过调节气孔孔径来调节渗透胁迫耐受性。此外，WRKY70，WRKY46和WRKY54参与了BR调节植物的生长和干旱响应。这表明WRKY70与气孔孔径有关，可能受到干旱和O3处理的影响。作为聚类1中的主要TF，在“NF40_W”下诱导了HB1（HAT5，HD-Zip-1）（图5）。在缺乏维生素C的拟南芥突变体vtc1中，ABA调节基因的表达和ABA含量增加；HB1也被诱导。此外，来自玉米的同源物Zmhdz10通过激活包括ABI1，RD22，RD29B和P5CS1在内的胁迫/ABA响应基因，正调节水稻和拟南芥的干旱和盐分耐受性。此外，在CF_D下，聚类7中的ABF2（AREB1）被高度诱导，而在NF40_D下被缓解（图5），且众所周知，它是通过与ABA响应元件相互作用而参与多重胁迫耐受性的必需TF。这些研究表明，HB1和ABF2通过ABA依赖性信号通路参与了多种胁迫耐受性调控。据报道，MEP/DOXP途径也与叶面ABA和气孔开放有关。当MEP/DOXP途径被阻断时，异戊二烯的排放被抑制，叶片ABA含量降低，叶片气孔导度显著提高。这意味着MEP/DOXP途径会生成对环境变化快速响应的不稳定的ABA库。在本研究中，在杨树对干旱和/或O3的响应中，鉴定了102种被Helitron捕获的DEG（图6），并且它们主要被富集在与离子迁移相关的过程（图S4）。众所周知，ROS在离子转运的调节中起着重要的作用，并且穿过质膜的Ca2+内流的诱导是ROS信号转导的核心，并且与气孔关闭有关。此外，ABA还作为调节守卫细胞K+和阴离子通道活性的信号。OST1（一种与SNF1相关的蛋白激酶）和PP2CA（一种2C型蛋白磷酸酶）可以通过激活或抑制慢阴离子通道（SLAC1）以相反的方式通过ABA调节气孔运动。有趣的是，在Helitron捕获的8个TF中，OZF2/TZF3（一种C3H型锌指家族蛋白）已被证明通过ABI2介导的信号途径参与ABA反应。分别由hel_ptr_fwd_050和hel_ptr_fwd_627捕获的高度ABA诱导的PP2C基因2（HAI2）和ABI5结合蛋白3（AFP3）也参与ABA信号途径（表S5）。在生物体中，功能蛋白可以与其他蛋白发生物理相互作用以形成更大的复合物。最近，一项研究报道了将SnRK1与拟南芥中的多种信号通路链接的PPI网络，这暗示了PPI在植物生长调节和环境响应中的重要作用。值得注意的是，在CF_D和NF40_D条件下，微管蛋白结构域蛋白均被富集在下调-PPI网络中（图7）。据报道，ROS以各种方式影响微管蛋白的细胞骨架。ROS失衡会迅速引起微管蛋白乙酰化或微管酪氨酸化水平的轻微变化。富集的微管蛋白域蛋白相互作用可能是由O3和干旱胁迫下ROS失衡引起的。Hsps是参与各种胁迫响应的分子伴侣，它们受Hsfs转录调控。在NF40_D下比CF_D减少的Hsp或Hsf PPI关系暗示了升高的O3抵消了杨树对干旱的分子响应。本研究报告了转录组的综合分析，重点鉴定了杨树响应于O3/干旱单一和多重胁迫的关键调控因子。在O3（NF40_W），干旱（CF_D）和复合胁迫（NF40_D）下分别确定了93、2560和977个DEG。O3可以有效缓解干旱条件下的转录组变化。此外，参与异戊二烯生物合成的DEG在高浓度O3处理下被下调并通过干旱处理得以恢复，而参与ABA信号通路的DEG在干旱处理下被上调并通过O3处理而被恢复。经过聚类分析和TF结合位点扫描后，总共鉴定出12个核心TF，它们可能在O3和/或干旱响应中起着重要的调节作用。此外，携带DEG的102个Helitron对O3和/或干旱有响应，这可能与ABA依赖性途径有关。这些发现提供了O3和干旱对杨树复合影响的综合见解。
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