科研 | PLANT CELL ENVIRON: 壳聚糖引发植物对灰葡萄孢的防御机制，包括Avr9/Cf-9快速诱导基因的表达
编译：Nicole，编辑：景行、江舜尧。
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当前针对真菌病原灰葡萄孢的防控策略依赖于常规杀真菌剂和宿主遗传抗性的组合，然而这些策略不足以保护植物免受这侵害。植物诱抗剂可以通过引发防御的现象来激发植物防御机制，引发导致病原体被宿主识别时更快和/或更强的抗性。本文旨在研究诱抗剂壳聚糖的商业配方引发的防御。壳聚糖处理可导致茄科和芸苔科植物产生诱导抗性。在番茄中，增强的抗性与引发愈伤组织沉积和植物激素茉莉酸（JA）积累有关。大规模的转录组分析表明，壳聚糖在感染后更早的启动了基因表达。此外，鉴定了2个具有特征性启动图谱的新基因：Avr9/Cf-9快速诱导蛋白75（ACRE75）和180（ACRE180）。ACRE75、ACRE180及其本生烟草同源物的过表达表明，它们是植物抗灰葡萄孢的正调节剂。本文为寻找茄科植物抵抗灰葡萄孢的策略提供了有价值的信息。
论文ID
原名：Chitosan primes plant defence mechanisms against Botrytis cinerea, including expression of Avr9/Cf-9 rapidly-elicited genes
译名：壳聚糖引发植物对灰葡萄孢的防御机制，包括Avr9/Cf-9快速诱导基因的表达
期刊：PLANT CELL AND ENVIRONMENT
IF：6.362
发表时间：2020年6月
通讯作者：Adrian Newton、Estrella Luna
通讯作者单位：英国James Hutton研究所和伯明翰大学
DOI号：10.1111/pce.13921
实验设计
结果
测试了水溶性壳聚糖基商业制剂ChitoPlant（以下称为壳聚糖）在诱导针对真菌病原体灰葡萄孢的抗性方面的能力。壳聚糖的处理表明，其成功触发了番茄（图1a）、拟南芥（图1b）和茄子对灰葡萄孢的抗性。在番茄中，与对照植物相比，壳聚糖在所有浓度下均显着降低了坏死病灶的大小（图1a）。壳聚糖诱导的诱导抗性表型在两种高浓度（1％和0.1％）下具有剂量依赖性，但是，最低浓度（0.01％）在0.1％至1％的处理中诱导了耐药水平。在拟南芥中，壳聚糖处理以浓度依赖的方式诱导了诱导抗性，其中1％的诱导抗性最强（图1b）。
进一步测试了壳聚糖是否以与其他壳聚糖制剂相似的方式诱导胼胝质沉积。在苯胺蓝染色前一天，用增加浓度的壳聚糖处理植物。在两种植物中，壳聚糖处理均直接诱导愈伤组织。番茄和拟南芥中的最低浓度分别为0.001％和0.01％触发了最强的作用（图1c和d）。
为了确定壳聚糖的抗真菌作用，在体外测试了不同浓度对灰葡萄孢菌丝生长的影响，并将其与不同浓度的杀菌剂Switch（Syngenta）进行了比较。尽管所有浓度的Switch均可阻止病原体生长，但只有0.1％的壳聚糖浓度或更高浓度才具有抗真菌作用。但是，与对照相比，低壳聚糖浓度（0.01％）没有抗真菌作用，但是减少了灰葡萄孢的损害并诱导了愈伤组织的形成，因此选择该浓度进行更深入的分析。
图1.壳聚糖诱导的番茄和拟南芥抗性的特征。（a）接种后3天番茄的病害和（b）拟南芥的病害。（n = 4-10）。（c）壳聚糖处理在番茄和（d）在拟南芥叶片喷雾处理后1天。值代表每叶面积胼胝质的％的平均值±SEM（n = 8-10）。
2 标记壳聚糖诱导抗性的防御启动机制分析
通过评估其在植物远端诱导持久抗性的能力，测试了脱乙酰壳多糖引发的诱导抗性是否由启动机制介导。番茄植物的初始处理后，用1％的壳聚糖处理可诱导至少2周对灰葡萄孢的持久抗性（图2a）。
为了评估壳聚糖处理是否直接影响植物发育，在用1％壳聚糖处理一周后测试了植物生长。这些实验表明，壳聚糖处理触发了显着的生长促进，因此表明壳聚糖诱导的抗性不会对植物发育产生负面影响。
为了研究壳聚糖诱导的诱导抗性（IR）是否基于已知的引发机制，在感染后进行了胼胝质和激素分布分析。与用水处理的植物相比，用壳聚糖处理导致胼胝质沉积增加约两倍（图2b、c）。此外，对防御依赖性激素的质谱分析表明，壳聚糖诱导的抗性是由茉莉酸（JA）（其氨基酸共轭物JA-异亮氨酸（JA-Ile））的积累专门介导的。相反，未发现其他防御激素如水杨酸（SA）和脱落酸（ABA）的浓度受到其他影响（图2d）。因此，壳聚糖-IR基于诱导感染部位的愈伤组织以及JA及JA-Ile的积累。
图2.壳聚糖的诱导抗性是基于引发的。（a）用水（对照）或1％脱乙酰壳多糖处理后2周，接种后3天（dpi），番茄的病害。（n = 8）。（b）与灰葡萄孢感染后1天的真菌病变直径相比，水（对照）和脱乙酰壳多糖（0.01％）处理的植物中在感染部位胼胝质沉积的百分比。（n = 4）。（c）在感染部位壳聚糖诱导的胼胝质代表性图片。蓝色对应于真菌的生长，而黄色对应于在感染部位的胼胝质沉积。比例尺= 0.5毫米。（d）感染后24h的水杨酸（SA），茉莉酸（JA）和脱落酸（ABA）的质谱定量（ng / mL）。值表示平均值±SEM（n = 4）。
3 壳聚糖诱导抗性的转录分析
基因表达的启动通常遵循一种特征模式：仅用激发子处理后（即壳聚糖+对照），差异表达低，短暂或无法检测到，与未用化学试剂预处理的受感染植物（即水+灰葡萄孢）相比，差异表达在随后的感染后（壳聚糖+灰葡萄孢）增强。为了进一步确定壳聚糖诱导的诱导抗性的基础，本文在灰葡萄孢感染后（hpi）的第6、9和12小时进行了完整的转录组分析。在感染后的不同小时进行主成分分析（PCA）表明，壳聚糖处理并未触发转录的变化，但是灰葡萄孢的感染极大地影响了实验（图3a）。此外，尽管在9和12 hpi时可以观察到对照和灰葡萄孢感染的重复之间存在分离，但在6 hpi的早期时间点PCA中没有发现明显的差异。
在所有三个处理和时间点中鉴定出1,722个差异表达基因（DEG）。与第一个时间点的水+对照处理相比，分层聚类将基因分为四个粗略的组（6 hpi，图3b）：聚类簇i由受到灰葡萄孢菌感染抑制的基因组成；簇ii代表仅通过壳聚糖处理诱导的基因；簇iii包括在以后的时间点受灰葡萄孢感染和壳聚糖处理所抑制的基因；簇iv在以后的时间点受灰葡萄孢感染和壳聚糖处理所诱导的基因（图3b）。总体模式与先前的发现一致，即与壳聚糖处理相比，灰葡萄孢感染对番茄的转录具有大规模、更广泛差异的反应（图3a）。此外分析表明，壳聚糖的应用导致抑制的基因数量比诱导的基因更高，除了簇iv中一些高度诱导的基因外。壳聚糖处理与灰葡萄孢感染相比有明显差异。灰葡萄孢在9和12 h差异诱导了簇iv中的一大批基因，以及簇i中病原体所抑制的一大批基因。这表明壳聚糖是一种引发剂，不会直接触发基因转录的主要作用。
为了研究负责引发壳聚糖抗灰葡萄孢的不同信号传导途径和特定基因，双向方差two-way ANOVA分析确定了所有三种处理和时间点之间的8,471个差异表达基因（DEG）。韦恩图表明，壳聚糖自身的作用不会触发基因转录的重大变化：壳聚糖+对照，水和对照处理分别在6、9和12 hpi差异表达15、36和20个基因（图3c）。但是在植物感染灰葡萄孢后，壳聚糖的作用更为明显。
这种组合导致分别在6、9和12 hpi时分别产生543、2,011和2,967个基因的差异表达，其中仅在壳聚糖、灰葡萄孢处理中诱导了260、991和723个DEG（图3c）。相比之下，水+灰葡萄孢处理分别在6、9和12 hpi分别显示327、1,134和2,697个基因的差异表达，其中70、116和501个DEGs对水+灰葡萄孢处理具有特异性（图3c）。这些结果表明，存在一些可能负责壳聚糖诱导的启动反应的基因，导致对灰葡萄孢的更快和更强效的响应。
为了进一步鉴定参与壳聚糖诱导的启动反应的早期信号通路和基因，对与仅在壳聚糖+灰霉病处理后6 h差异表达的260个基因进行了进一步分析。对于生物过程，诸如刺激、化学和生长素反应等途径被过度代表（表1）。此外，对于分子功能、半胱氨酸型肽酶活性、转录因子活性、序列特异性DNA结合和核酸结合转录因子活性基因富集（表1）。
图3.壳聚糖诱导的对灰葡萄孢的抗性的转录组分析。（a）在感染（hpi）后6、9和12小时对整个转录组进行主成分分析（PCA）。（b）差异表达基因的热图（2-way ANOVA p <0.01）。显示了与水+对照相比，用壳聚糖+/-处理和在6、9、12 hpi对数倍数诱导（红色）或抑制（蓝色）的灰葡萄孢感染的概况。表达谱上的层次聚类大致分为i、ii、iii、iv。（c）差异表达基因的统计显着性数据集（2-way ANOVA p <0.01）的维恩图。对三种测试处理方法进行成对T检验比较（火山图：p <0.05，2倍临界值）。
表1.富集基因的生物学过程和分子功能。
4 壳聚糖启动基因的鉴定
首先，对9个基因的子集进行qRT-PCR分析，验证转录组表达数据。选择在最早时间点（6 hpi）受到差异调节的转录本，以鉴定参与早期免疫反应的启动基因。在水+对照、壳聚糖+对照和水+灰葡萄孢上分析了壳聚糖+灰葡萄孢在6 hpi时独特的260 DEG子集的表达（图3c）。从该子集中，发现203个下调基因和57个基因上调基因。
在感染过程中被抑制的203个基因中，有11个转录物与半胱氨酸型肽酶活性有关。其他转录本与光合作用、光系统I活动中的光收集分组聚类在一起。而且有些对激素的活性有反应。与水+灰葡萄孢相比，9个乙烯响应转录因子和受体基因从-2,3显着下调至-1,1。其他具有强大启动功能的著名基因包括具有蛋白水解活性的基因，其抑制范围为-3至-1,7倍。其他表达受抑制的基因属于植物生长素激素、ABA受体（ABAPYL4）。此外，两个鲜为人知的横向器官边界（LOB）基因受抑制。
在57个差异表达上调的基因中，编码过氧化物酶活性的1个转录物比水+灰葡萄孢增加了2倍，编码蛋白激酶活性的9个转录物编码了+1,1到+2,1倍。还有编码转录调控活性的5个转录物，包括SlMYB20、SLWRKY51和SlWRKY72。
重要的是，未表征的基因也显示了启动表达模式。其中，在6 hpi时Avr9 / Cf-9快速诱导蛋白75（ACRE75；Solyc11g010250.1）在壳聚糖+灰葡萄孢中比的水+灰葡萄孢中上调了1.6倍。先前已经研究了ACRE基因参与R基因介导且不依赖ROS基因的早期植物防御反应和茉莉酸甲酯（MeJA）处理的反应。ACRE75分子的功能仍有待进一步研究，因此进一步研究了其功能以及ACRE基因家族其他成员在壳聚糖防御启动中的作用。
5 ACRE基因在灰葡萄孢诱导抗性中的作用
为了研究ACRE基因家族的其他成员是否显示与ACRE75类似的启动图谱，对在6 hpi差异表达的基因子集进行了相关分析。鉴定出具有统计学上显着相似特征的基因，其中包括置信值为0.956的ACRE180。此外，在实验的后期对样品进行分析，确认ACRE75和ACRE180均在随后的时间点被启动。
为了研究ACRE75和ACRE180基因的启动表达是否可能与增强的抗病性有关，对番茄及本氏烟草同源基因进行过表达。对于SlaCRE75，本氏烟草基因组中最佳匹配是Niben101Scf03108g12002.1（称为NbACRE75），具有77.5％的蛋白质一致性。对于SlaCRE180，本氏烟草的基因组中最佳匹配是Niben101Scf12017g01005.1（称为NbACRE180），具有49.5％的蛋白质一致性。拟南芥直系同源物分析未能鉴定出ACRE75和ACRE180基因。对本氏烟草中通过融合GFP荧光分析蛋白质的亚细胞位置。将过表达的载体与RFP标记pFlub载体共同浸润到本氏烟草CB157（核mRFP标记）和CB172（ER mRFP标记）中。显示游离的GFP积累在细胞质和细胞核中，而GFP-S1ACRE75和GFP-NbACRE75融合蛋白仅积累在本氏烟草细胞的细胞核和核仁中。此外，GFP-S1ACRE180融合仅在ER中积累，而GFP-NbACRE180融合仅在过氧化物酶体中积累。
为了进一步研究ACRE基因的过表达对抗性的影响，将4个含有GFP-SlACRE75、GFP-S1ACRE180、GFP-NbACRE75和GFP-NbACRE180以及GFP空载体（EV）的载体注入本氏烟草后感染灰葡萄孢。壳聚糖诱导的针对灰葡萄孢的抗性被证明是有效的（图4a）。与EV对照相比，所有注入GFP-S1ACRE75、GFP-SlaCRE180、GFP-NbACRE75和GFP-NbACRE180的本氏烟草叶片均显示出灰葡萄孢坏死病灶大小的显着降低（图4b）。为了进一步分析ACRE75和ACRE180的生物学功能并确认其在植物对灰葡萄孢的抗性中的作用，将拟南芥植物转化为组成型过表达GFP-S1ACRE75、GFP-S1ACRE180、GFP-NbACRE75和GFP-NbACRE180。与Col-0和GFP-EV对照相比，转基因GFP-S1ACRE75、GFP-S1ACRE180、GFP-NbACRE180和GFP-NbACRE75过表达植物均显示出增强的抗性表型，且灰葡萄孢坏死病灶大小明显降低（图4c）。此外，在6 dpi时，GFP-S1ACRE75及其同系物GFP-NbACRE75过表达植物显示出对灰葡萄孢的抗性高于GFP-S1ACRE180和GFP-NbACRE180过表达株（图4c）。
图4. ACRE基因的功能表征。（a）壳聚糖对本氏烟草的诱导抗性。接种后2天（dpi）的病灶。值代表平均值±SEM（n = 18）。（b）瞬时表达组成活性SlaCRE75、SlaCRE180、NbACRE75和NbACRE180的本氏烟草感染灰葡萄孢的坏死病灶。在感染后4天进行病变大小测量。（c）稳定过表达的SlaCRE75、SlaCRE180、NbACRE75和NbACRE180的拟南芥感染灰葡萄孢的坏死病灶。在接种后6天（dpi）测量病变大小。
讨论
本文评估了壳聚糖在不同植物物种中诱导对灰葡萄孢的抗性的能力，并将其作用与防御机制的启动联系起来。壳聚糖处理在一定浓度范围内导致了番茄图1a）、拟南芥（图1b）和本氏烟草（图4a）的诱导抗性，表明存在与真菌PAMP的反应类似的防御作用。此外，壳聚糖处理可激活基础抗性过程，例如胼胝质在细胞壁上的沉积（图1c、d），这被认为是抵抗病原体入侵的重要因素。在拟南芥中抗性的表达取决于使用的壳聚糖浓度。相反，在番茄和茄子中，抗性水平不取决于壳聚糖的浓度。此外，壳聚糖诱导的番茄和拟南芥中的愈伤组织沉积没有遵循经典的剂量反应曲线，激活愈伤组织的最有效方法是降低激发子的浓度（图1c、d）。有研究表明其他引发剂在较低浓度下会引发诱导的诱导抗性现象，高剂量的MeJA对生理过程具有有害影响，并且总体上降低了保护效率。这与低浓度的壳聚糖不会直接影响病原体生长的观察结果一致，壳聚糖诱导的诱导抗性的作用存在浓度阈值。
壳聚糖的叶面施用已被广泛用于控制由多种害虫和病原体引起的疾病发展。然而，很少有研究研究壳聚糖作为引发剂的作用，并且大多数研究都集中在其作为种子的用途上，主要是为了改善发芽和产量。本文表明壳聚糖诱导的抗性是基于防御机制的启动。本文表明壳聚糖诱导的抗性与生长减慢无关，在处理后至少两周是持久的且可维持的（图2a），这是基于愈伤组织更强的JA（图2d）和JA-ile的积累。这些结果表明，壳聚糖处理后的真菌生长停滞不是直接由化学物质的毒性作用介导的。此外，这些结果证明了壳聚糖处理后与其他引发剂（包括Hx）具有相似的启动机制。有趣的是，尽管有许多报道说植物激素之间存在拮抗和其他串扰相互作用，但SA和ABA的浓度并未受到影响。这表明壳聚糖的防御启动不会导致其他激素依赖性信号通路的下调，从而可能保持对其他压力的有效抗性。
为了进一步探讨防御的启动作用并揭示壳聚糖诱导的抗性背后的转录机制，本文进行了转录组分析。使用与防御启动相关但没有直接抗菌作用的壳聚糖浓度，确定了早期作用的差异转录组变化。结果表明，壳聚糖处理不会导致主要的转录变化（图3a）。相比之下，水+对照和壳聚糖+灰葡萄孢的处理比较表明DEG数量更多（图3b、c），因此表明植物对激发子的启动特性做出了反应。
在6hpi时，壳聚糖+灰葡萄孢DEG的下调数量是上调的3倍以上（203下调、57上调）。这表明番茄植株可能会抑制易感因素，以减少灰葡萄孢对宿主防御的操纵。有趣的是，一些下调的转录本编码半胱氨酸型肽酶。据报道这些蛋白在抵抗病原体包括灰葡萄孢中具有作用。其他下调的基因与植物激素活性有关。包括乙烯AP2 / ERF转录因子和ABA PYL受体（SlABAPYL4），据报道它们参与了防御反应，充当JA / ET依赖性抗灰葡萄孢防御的正或负调节剂。上调的基因包括编码过氧化物酶和转录调节活性的转录物，例如过氧化物酶5、SlMYB20、SLWRKY51和SlWRKY72，具有锌指结合结构域和NAC结构域蛋白的CONSTANS样蛋白以及涉及蛋白降解的RING型E3泛素转移酶。这些基因与防御反应有关。重要的是，最近关于拟南芥中壳聚糖寡糖对细菌病原体丁香假单胞菌的启动作用的研究也揭示了类似信号通路在抗性表达中的作用。总而言之，这些结果表明壳聚糖引发了番茄和拟南芥的免疫系统，从而增强了对不同性质病原体的抵抗力。
转录组学（图S4a）和qRT-PCR分析表明，壳聚糖可以引发灰葡萄孢感染后ACRE75更快、更高地表达。ACRE基因已经证明与植物防御反应相关。为了确定ACRE基因在壳聚糖引发中的作用，本文搜索了其他表达与ACRE75类似的表达谱的ACRE基因，发现ACRE180显示了相似的表达谱。在9 hpi时比在6 hpi时更明显，这表明ACRE180的作用比ACRE75的作用晚。亚细胞定位可能表明为什么这些基因的启动不能同时发生。ACRE75仅在核和核仁中积聚，而ACRE180在ER和过氧化物酶体中积聚。这表明这些蛋白质具有不同的分子功能。此外，可以推测ACRE75和ACRE180是同一信号传导途径的一部分，一个在另一个的上游起作用，因此证明了ACRE180的延迟转录和活性是合理的。
通过分别在本氏烟草和拟南芥中的瞬时和稳定系统中过表达这些基因，研究了ACRE75和ACRE180在壳聚糖诱导的启动中的作用。ACRE75和ACRE180缺乏信号肽，这表明它们可能编码受感染细胞内信号传递或激活抗菌反应的小蛋白。ACRE75和ACRE180可能参与了茄科植物独特化合物的生产。SlaCRE75和SlaCRE180及其本氏烟草直系同源物的过表达导致诱导的对灰葡萄孢的抗性（图4b、c）。因此，结果证实了ACRE基因参与植物免疫，并由于其表达谱而暗示了壳聚糖诱导的引发。有趣的是，与ACRE180相比，在过表达ACRE75的拟南芥植物中诱导的抗性作用更大（图4c），这可以证实ACRE75的早期活性，因此在早期抗性反应中更有效。需要更多的工作来阐明ACRE75和ACRE180的分子功能。该结果揭示了壳聚糖诱导的番茄对灰葡萄孢抗性启动的潜在分子途径，可能适用于其他农作物。
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