编译：思越，编辑：夏甘草、江舜尧。
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导读
细胞的命运和功能是受到信号传导、表观遗传、转录和代谢途径的整合调控。目前仍缺乏将细胞转录状态与细胞内蛋白活性联合分析的有效方法。在本文中，作者开发了细胞内染色和测序集成技术(INs-seq)，用于同时记录单细胞RNA测序（scRNA-seq）的mRNA表达和细胞内蛋白质活性。通过分析免疫信号传导、转录因子组合和代谢活性的细胞内差异，证明了INs-seq在发现新免疫子集方面的广泛用途。运用INs-seq技术，作者成功地对T细胞的亚型进行特性描述，并且发现了Trem2是两类肿瘤浸润性骨髓抑制细胞的标志物。通过对TREM2的基因消融抑制了肿瘤内Mreg细胞的积累，导致功能异常的CD8 + T细胞明显减少，并抑制肿瘤生长，提示抑制TREM2似乎是治疗具有免疫治疗抗性的癌症的有效方法。
原名：Coupled scRNA-Seq and Intracellular Protein Activity Reveal an Immunosuppressive Role of TREM2 in Cancer
译名：scRNA-Seq和细胞内蛋白活性联合分析揭示了TREM2在肿瘤免疫抑制中的功能
期刊：Cell
IF：36.216
发表时间：2020年8月20日
通讯作者：Ido Amit & Assaf Weiner
通讯作者单位：以色列威兹曼科学研究所
DOI号：10.1016/j.cell.2020.06.032
1.INs-seq:单细胞测序与细胞内蛋白检测的整合技术
为了整合细胞内蛋白活性与细胞转录组图谱信息，作者开发了INs-seq技术（图1A），流程包括使用甲醇（MeOH）和硫酸铵溶液固定、荧光偶联抗体进行蛋白标记、FACS通过荧光信号强度分选细胞并进行单细胞测序。为了评估INs-seq中保存RNA和进行蛋白标记的效率，作者使用INs-seq固定液与多聚甲醛（PFA）、甲醇（MeOH）和二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)（DSP）四种方法对小鼠骨髓源性细胞（BMDC）分别进行处理，发现除了DSP处理的细胞，其他均显示出清晰的 pP38荧光信号（图1B）；并通过PCR定量检测cDNA的保存情况，发现INs-seq保存的mRNA量是最多的，并且可以储存在20℃的环境中2周（图1C）。通过构建单细胞测序文库并进行后续分析，发现INs-seq固定的样品相比于新鲜样品，虽然UMI的数量减少了50%–60%（图1D），但是这种减少没有细胞特异性，两者的细胞分布较为一致（图1E、F）。接着，作者在人类外周血单核细胞（PBMC）进行了重复，除了INs-seq样本中一个单核细胞亚群有少量富集外，细胞群体分布总体上具有很高的相似性（图1G、H），这些结果表明，INs-seq 在标记细胞内蛋白质的同时，能够保持单个细胞内 mRNA 的含量。
图1 INs-seq：单细胞测序和细胞内蛋白质检测的集成技术
2.INs-seq鉴定出树突状细胞的炎性细胞因子信号延迟
髓细胞由不同的细胞类型组成，且对环境信号的反应是不同的。为了更好地了解髓细胞对信号反应的复杂性，作者使用INs-seq，探究髓细胞对 TLR4激动剂脂多糖(LPS)的反应，并使用TLR4信号级联下游组分pp38进行荧光染色（图2A）。在BMDC中共鉴定出4个细胞群，包括单核细胞、循环单核细胞、树突状细胞（DC）和单核细胞-树突状细胞群（图2B）。通过对每个亚群进行pp38富集分数的评估，发现pp38+树突状细胞显著减少（图2C、D）。LPS通常通过TLR4通路及其辅助受体CD14起作用，通过比较4种细胞群的TLR4、CD14及TLR4分子接头MyD88的表达，发现树突状细胞中TLR4、CD14及MyD88的表达降低（图2E），且在LPS的刺激下树突状细胞群相比于单核细胞群，仅产生了轻微的炎症反应（图2G）。总之，INs-seq是一种较稳健的单细胞转录和信号活性表征技术，树突状细胞在LPS刺激下，出现了pp38 MAPK和下游的炎性细胞因子信号的延迟。
图2. INs-Seq检测LPS刺激后pp38 MAPK活性变化
3.通过靶向转录因子以鉴定细胞类型
转录因子具有序列特异性，参与细胞的发展轨迹以及对细胞外信号反应，并具有应用于免疫细胞亚群精确表征的潜力。转录因子Foxp3是调节T细胞（Treg）的调控因子，可用于区别其他T细胞。作者在Foxp3-RFP转基因小鼠体内鉴定INs-seq使用Foxp3标记Treg细胞的能力，通过对比荧光蛋白分选TCRb+ RFP+细胞和使用INs-seq分选抗体染色的TCRb + Foxp3 +细胞以富集Treg细胞（图3A），发现颈部淋巴结都检测到了相似的Treg细胞富集（图3B），并分离肿瘤浸润性淋巴细胞(TILs)并应用INs-seq鉴定肿瘤微环境中的Treg细胞，发现Foxp3 +细胞包含Treg细胞及其相关的转录组学特征，并表达高水平的 Gzmb，Ccr2，以及 TNF 受体家族成员18和9（图3C）。总之，通过靶向来自小鼠淋巴结和肿瘤微环境的Treg细胞特异性转录因子Foxp3，可以将INs-seq与scRNA-seq联合应用。
4.T细胞转录因子图谱鉴定记忆性T细胞标志物
作者接着使用INs-seq通过人类外周血单核细胞（PBMC）去鉴定不同状态的T细胞的分子标记物，其中包括转录因子Foxp3和两个CD8 T细胞转录因子TCF7和ID2。发现 CD3+FOXP3+样本与来自同一捐赠者的PBMC样本进行比较，结果显示CD4 Treg细胞富集，并表达经典的Treg细胞标记FOXP3、TNFRSF4、IL2RA、IKZF2和TIGIT（图3D，E）。TCF7和ID2已被证明在记忆性CD8T细胞中表达，但仍不清楚其在决定CD8 T细胞状态方面的相互作用。相比于CD45+，TCF7+显示与初始CD8 T细胞相关基因模块的表达（图3F，I，J）。ID2+主要与效应CD8 T细胞的表型相关，表达包括与细胞毒性机制相关和细胞毒性T细胞的基因（图3G，I，J）。TCF7+ ID2+主要富集了中央型记忆T细胞和效应T细胞（图3H）。综上，INs-seq是在单细胞水平研究不同转录因子间调控细胞状态的有力工具。
图3.INs-seq 转录因子图谱鉴定T细胞亚型
5.Trem2鉴定两种肿瘤浸润性骨髓抑制细胞亚群
除了广谱标志物CD11b和Gr-1外，分类髓系抑制细胞的表面标志物仍十分有限。Arg1参与肝功能和胶原蛋白生成等生物学过程，髓系抑制细胞群可激活 Arg1通路，剥夺微环境中T细胞所需的精氨酸。为了对髓系抑制细胞进行分类，作者使用INs-seq从小鼠肿瘤模型中分离 arg1表达细胞，并确定它们的细胞和分子通路（图4A），从髓细胞Arg1图谱中去除了淋巴细胞、粒细胞和树突状细胞群后，共鉴定出77个metacells组成6个不同的细胞群（图4B、C），并通过计算Arg1富集分数发现与其转录水平高度相关。其中鉴定出2个Arg1+细胞亚群：肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）和调节性髓样细胞（Mreg）亚群，并通过共表达基因集分析得到细胞表面膜糖蛋白Pdpn和髓样受体Trem2在TAM和MREG细胞亚群中，与Arg1表达显著相关。接着作者通过qPCR验证Arg1和Trem2的表达关系，使用Pdpn，Cx3cr1和Gpnmb作为Arg1+细胞亚群，发现这些亚群相比于Arg1-亚群（Ly6C），具有更高的Arg1和Trem2转录表达（图4D和E），且这些亚群可通过流式很好地区分（图4F），并在质谱流式仪中验证得到相似的结果（图4G）。总之，INs-seq通过Arg1和Trem2鉴定出了2种不同的髓细胞亚群。
图4 Trem2鉴定两种肿瘤浸润的髓系抑制细胞亚群
6.Trem2促进T细胞功能障碍和肿瘤免疫逃逸
为了验证INs-seq的肿瘤图谱，作者通过MARS-seq从肿瘤组织中分选出CD45+免疫细胞，在115个metacells对髓细胞进行分析（图5A）。与INS-seq肿瘤图谱相似，Arg1的表达与Trem2和Pdpn的表达高度相关（图5B），Arg1+TREM2+被分成了Cx3cr1, Apoe和C1qa标记的TAMs和Gpnmb, Il7r标记的Mreg亚群（图5B-D）。此外，作者发现许多转录因子与髓细胞抑制有关，如Maf、Cebpb、Atf3、Hif1a和Spi1、Hif1a可能是Mreg和TAMs的潜在调控因子（图5E）。由于TREM2与Arg1+髓系细胞高度相关，并已被证明在各种病理中促进髓系细胞的增殖、存活和免疫抑制，作者认为Trem2可能在肿瘤微环境中发挥了作用。作者使用N9细胞和crispr技术构建Trem2缺失模型，发现CD8+T细胞与N9细胞共培养明显抑制了CD8+T的细胞增殖，而在Trem2缺失N9细胞中并未抑制。作者接着在体外构建了Trem2野生型和敲除型小鼠，观察到敲除小鼠的肿瘤体积显著缩小（图5F）。接着作者对野生型和敲除型小鼠的免疫细胞进行测序以进一步研究Trem2在肿瘤内免疫环境中的作用，发现在Trem2敲除的髓细胞中，Mreg亚群的Trem2数量明显减少，而在TAM亚群中增加（图5G），且Mreg亚群的CD8+失活T细胞明显减少，NK细胞和细胞毒性T细胞的数量显著上升。在T细胞增殖实验中，Mreg亚群明显抑制了CD8+ T细胞的增殖（图5H）。总之，Arg1+肿瘤浸润髓细胞包含两个分子水平不同的髓样细胞群：TAMs和Mreg，但只有Mreg亚群受到Trem2消融的影响。此外，TREM2的缺失使巨噬细胞系和肿瘤微环境的免疫抑制显著减少，进而重新激活了免疫系统，抑制肿瘤生长。
图5 Trem2促进T细胞失活及肿瘤免疫逃逸
本文开发了一种新的细胞内染色和测序集成技术(INs-seq)，将大规模单细胞测序(scRNA-Seq)与细胞内蛋白质测量技术结合起来，并成功用于细胞内和翻译后修饰蛋白(PTM)、信号通路、转录因子(TF)和代谢相关蛋白图谱，有助于理解控制细胞功能的表观遗传、转录、信号和代谢通路之间相互作用。根据pp38 MAPK的翻译后修饰来表征体外髓系细胞，发现树突状细胞与单核细胞的差异激活，并证明了INs-seq鉴定新型免疫细胞亚群的能力，INs-seq明确了TCF7 和ID2在控制CD8 T细胞状态中的相互作用，并确定了PBMC中效应T细胞和CMT细胞的分子图谱；对FOXP3+免疫细胞的特征分析确定了来自不同组织的 Treg 细胞的独特分子标记。对精氨酸酶1细胞的全面分析发现了新型Arg1+Trem2+调节性髓样细胞（Mreg）亚群，并通过基因消融证实TREM2是髓系抑制细胞的标志物和重要调节因子。
图6 概要
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