科研 | 深圳大学李猛组Microbiome: 红树林生态系统新型产甲烷菌的代谢潜力（含视频介绍）
编译：橙，编辑：小菌菌、江舜尧。
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产甲烷微生物可以产生温室气体甲烷，在全球碳循环和气候变化中扮演着重要的角色。产甲烷微生物有多个类群，包括最近发现的两类新型产甲烷微生物Methanofastidiosa和甲烷马赛球菌目，但是各类产甲烷微生物在红树林中的代谢机制及对甲烷释放的相对贡献，目前学界了解得还不够。
该研究从深圳福田红树林沉积物的宏基因组中构建出多个产甲烷微生物的基因组，分属于六个类群：Methanofastidiosa，甲烷马赛球菌目，甲烷微菌目，甲烷杆菌目，甲烷胞菌目和甲烷八叠球菌目。结合宏基因组学和宏转录组学的分析表明，两类新型产甲烷微生物Methanofastidiosa和甲烷马赛球菌目都具有利用H2还原甲基化合物的甲基营养型代谢途径。功能基因分析显示氢营养型和甲基营养型的产甲烷途径是红树林生态系统中主要的产甲烷代谢方式。进一步分析发现，氢营养型的甲烷微菌目是丰度最高的产甲烷微生物，甲基营养型的甲烷马赛球菌目是活性最高的产甲烷微生物，暗示着它们可能对于红树林的甲烷产生具有重要的贡献。
这一系列研究结果不仅拓展了人们对于两类新型产甲烷微生物生理生化代谢能力的了解，也使人们认识到各类产甲烷微生物对于红树林中甲烷排放的相对贡献。
论文ID
原名：Genomic and transcriptomic insights into methanogenesis potential of novel methanogens from mangrove sediments
译名：红树林生态系统新型产甲烷菌的代谢潜力
期刊：Microbiome
IF：10.465
发表时间：2020.6
通讯作者：李猛
作者单位：深圳大学高等研究院
视频简介
实验设计
该研究对深圳福田六个红树林不同剖面沉积物样本（0-30cm）进行DNA提取，并进行16S rRNA基因扩增子测序，调查各个样点的产甲烷菌分布以及产甲烷菌与其他微生物谱系之间的相互作用关系。后结合宏基因组和宏转录组分析研究了红树林生态系统中不同产甲烷菌在垂直沉积物剖面的代谢活性和对甲烷产生的相对贡献。
结果
1 产甲烷菌多样性与共生网络
对中国东南部红树林湿地的78个红树林沉积物样品进行了16S rRNA基因序列分析，发现红树林沉积物中含有多种产甲烷菌。在6个采样点中，深圳产甲烷丰度最高，约占原核生物的1.5%。红树林沉积物中广泛分布着Methanofastidiosa、Methanosarcinales和Methamonommicrobiales。此外，深圳红树林的优势产甲烷菌有Methomassiliicoccales、Methanofastidiosa、Methanosarcinales和Methomonommicrobiales。
基于78个红树林沉积物样品的16S rRNA基因序列的共生网络分析揭示了产甲烷菌与其他微生物分类群之间潜在的相互作用(图1)。根据O/R比，Micrarchaeota与产甲烷菌的非随机关联性最高。Woesearchaeota、Sedimenticola、Desulfobacca和Sulfurovum与产甲烷菌也表现出显著的非随机关联性。
图1 根据16S rRNA基因测序数据重建的共生网络。不同的颜色节点代表隶属于不同分类水平的OTU。连接节点的直线(边)呈强相关(r>0.6)和显著正相关(P<0.01)。O/R值是两个谱系(产甲烷菌和古菌或细菌)之间观察到的与随机共现的概率。O/R值大于1表示两个谱系之间非随机关联。
2 基因组重建
对福田自然保护区红树林沉积物的基因组测序数据进行重组装，重建了13个代表性产甲烷菌的MAG。并分析了基因组大小、GC含量、完整性和污染情况。12个MAG的完整度从69.8%到99.4%不等，1个MAG的完整度只有50.3%。污染率从0%到9.6%，使用CheckM进行评估。MAG基因组大小为0.61~2.33Mbp。
3 红树林沉积物样品产甲烷菌谱系组成及相对丰度
为了鉴定MAG系统发育组成情况，作者基于16S核酸蛋白基因（图2a）、McrA蛋白序列（图2b）和16S rRNA基因构建了系统发育树。其中4个MAG为两个新型谱系，MF1和MF2聚类为Methanofastidiosa，MMA1和MMA2聚类为Methanomassiliicoccales。剩余的9个MAG为传统产甲烷菌，其中MB属于Methanobacteriales，MC属于Methanocellales，MM1、MM2、MM3和MM4属于Methanomicrobiales，MS1、MS2和MS3 属于Methanosarcinales。
九个mcrA基因分别从13个MAG中获得（图2b）用于构建系统发育树。MB和MC基因组由于完整度不高，该基因序列缺失。来自于MM的McrA隶属于Methanolinea，来自于MS1的McrA隶属于Methanococcoides，来自于MS2的McrA隶属于Methanosaeta。
为了揭示红树林沉积物剖面的产甲烷菌重要情况，使用热图表示了产甲烷菌沿垂直剖面的相对丰度高低和活性大小（图2c）。MM是所有层中丰度最高的产甲烷菌。尽管MF和MS出现在所有的样品当中，但其相对丰度和活性相对较低。
图2 系统发育树揭示MAGs的系统发育特征（a）16S核酸蛋白基因和（b）McrA蛋白序列。（c）MAGs的相对丰度和表达水平高低。
4 红树林沉积物样品中产甲烷菌三种主要代谢通路的相对重要性
定量PCR分析结果表明不同样品之间产甲烷菌的相对丰度不同。mcrA基因拷贝数从105到106，且在6-8 cm丰度最高。
MAG注释结果反映了潜在产甲烷菌的代谢多样性。三种完整的代谢通路（氢营养甲烷化, 乙酸发酵型甲烷化和以甲基类化合物为底物的生物合成过程）被鉴定出来（图3）。MM和MS的MAGs为氢营养甲烷化通路，它们拥有关键的基因可以用来编码氢营养甲烷化，包括Fwd、Ftr、Mch、Mtd、Mer、Mtr和Mcr。MS的MAGs还包含乙酸发酵型甲烷化通路，它们拥有关键的基因Acs、Cdh、Mtr和Mcr，可以用来产生甲烷。此外MF、MMA和MS的MAGs包含编码甲基化合物甲基转移酶的基因，如Mts、Mta、Mtm、Mtb和Mtt。这表明以甲基类化合物为底物的生物合成过程的潜力。由于基因组不完整，MB和MC的MAG中没有完整的甲烷生成途径。
为了评估在垂直红树林沉积物剖面中甲烷生成的三个代谢途径的相对重要性，对相关基因的相对丰度和表达进行了评估（图4）。功能分析表明，与自养氢营养甲烷化相关的基因的相对丰度高于各层的乙酸发酵型甲烷化或甲基营养甲烷化途径。此外，参与氢营养和甲烷营养甲烷生成的基因也显著上调。
同时对不同MAGs的基因相对丰度大小和转录水平高低进行了评估。在MM中编码氢营养型甲烷生成代谢通路的基因在所有剖面相对丰度和表达水平较高。尽管MF中依赖H2的甲烷代谢途径有所表达，但代谢活力相对较低。MMA中的基因包括mts、mta、mtb、mtt和mcr，涉及编码甲烷基质还原的基因表达水平较高。
图3 四个主要的产甲烷菌谱系（MF,MMA,MM和MS）的代谢潜力。涉及碳、氮代谢、能量产生以及多种转运途径的基因使用不同的颜色进行区分。
图4 涉及三个主要甲烷产生途径的相对丰度（a）和表达水平（b）。三种代谢通路使用不同的颜色进行区分。
讨论
红树林的甲烷排放受到包括水产养殖和污水在内的人为活动的强烈影响。大多数原始红树林的甲烷外排速率较低，而有人为干扰的红树林甲烷外排速率明显较高。在本研究中，作者从红树林沉积物中回收并注释了13个产甲烷菌，其中包括两个新的产甲烷菌分类群：Methanofastidiosa和Methonomassiliicoccales。作者的目的在于展示新型产甲烷菌对甲烷生产的相对重要性。结果表明，根据转录本水平，Methonomassiliicoccales是最活跃的产甲烷菌。这些观察表明，两种新的产甲烷菌对甲烷的产生有贡献，并在碳循环中起着至关重要的作用。
在该研究中，作者对红树林沉积物中的多种产甲烷菌进行了鉴定和分析。McrA基因拷贝数在105-106之间。基因拷贝数较低可能是由于引物特异性所致。由于没有公认的新产甲烷菌引物，作者使用传统引物MLAS-MOD-F和MCRA-REV-R，主要针对传统产甲烷菌，对包括Methanofastidiosa和Methonomassiliicoccales在内的新型产甲烷菌的特异性较低，可能低估了产甲烷菌的真实丰度。因此，如果考虑到Methanofastidiosa和Methonomassiliicoccales，McrA基因拷贝数可能会更高。在6-8 cm层中观察到的拷贝数最高，甲烷丰度的垂直变化被认为与沉积物中物理化学因素的变化有关。0-2 cm层的总有机碳(TOC)浓度约为1.78 mg/g，28-30 cm层的总有机碳(TOC)浓度降至约0.96 mg/g。TN含量也从表层的1.61 mg/g降至深层的0.63 mg/g。由于河口环境中大量的陆地和河流营养物质到达并积累，潮间带沉积物的有机质含量高，这为产甲烷菌的生长提供了适宜的环境。
作者观察到，涉及乙酸发酵型甲烷化途径的基因相对丰度和表达水平较低。这可能是由于盐度在调节产甲烷群落中起着重要作用。福田红树林较高的硫酸盐浓度有利于硫酸盐还原菌。由于硫酸盐还原细菌对醋酸有较高的亲和力，因此比乙酸发酵型产甲烷菌具有热力学上的优势。乙酸发酵型产甲烷菌通常在淡水环境中占主导地位，例如厌氧消化器、稻田和淡水湿地。
MF、MMA、MM和MS是本研究中鉴定的四种优势产甲烷菌谱系。这与以前基于16S rRNA基因和MCRA测序的沿海沉积物中甲烷微生物的鉴定是一致的。福田自然保护区的红树林沉积物具有高硫酸盐浓度的特点，这表明适应高盐度对红树林栖息地很重要。因此，产甲烷菌应该保持与其周围环境相等的渗透压，这可能是通过积累有机渗透溶质来实现的。作者发现有机溶质转运蛋白基因在MF、MM和MS的MAGs中被鉴定。MF的MAG中还编码一种渗透保护转运蛋白。
值得注意的是，MM是各层中最丰富的产甲烷类群。此外，编码来自于MM的基因丰富很高，并且在各层都有表达。MM是红树林沉积物中主要的产甲烷菌群，这可能是因为它们的基因组中编码了大量的电子转运体，这有利于微生物适应底物(H2)环境。此外，MM编码多个膜结合的氢酶，包括Ech、EHA和Ehb。最后，MM具有一套完整的自养固碳还原性己糖磷酸(RHP)途径基因。这一途径最近被提出，可能在甲烷氧化菌中广泛分布。
在该研究中，首次报道了来自自然环境的MF基因组。MF的成员与传统的I类和II类产甲烷菌的不同之处在于缺乏编码CO2还原酶的基因。MF的成员缺乏MTR复合体，并使用H2作为产甲烷的还原剂。具体地说，MF的MAGS含有编码多种甲基化合物底物特异性甲基转移酶的基因，包括MTS、MTA、Mtb和Mtt。此外，它们还含有编码膜结合的能量守恒氢酶(Ehb)的基因，以产生H2。这两个过程可能与氢循环有关。这些观察表明，MF可以通过H2还原红树林沉积物中的多种甲基化合物来产生甲烷，而不是像之前所描述的那样，仅仅依赖甲基化的硫醇。这可能是由于红树林植物产生的甲醇和甲胺可以被甲基化营养甲烷菌利用。
转录组分析结果表明MMA是各层中最活跃的类群，表明MMA对红树林沉积物的波动环境具有很好的适应性。事实上，沿海沉积物对自然环境中甲烷生产的十分重要。MMA的MAG含有编码寡糖和单糖转运蛋白的基因，这可能说明了对异养生活方式的适应。后续应该从自然环境中获得分离株并对其进行分析，以验证其推断的生理特征。
实验设计
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