科研 | Nature Communication：饮食中的色氨酸通过肠道菌群调控自身免疫性神经炎症
编译：Jione、song，编辑：小菌菌、江舜尧。
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哺乳动物的宿主与其肠道菌群之间的相互作用会诱导机体产生适应性免疫应答。肠道受损，会诱导全身性T细胞反应失调，最终致使远端器官的自身免疫性疾病，例如类风湿性关节炎或者自身免疫性神经炎症等。共生肠道菌群控脑炎性制着抗原特异性T细胞向保护性调节T细胞或促炎T细胞分化。食物中的营养成分被微生物群分解成短链脂肪酸，而微生物的生态平衡受到特定饮食成分的影响。相关研究表明，营养成分强烈影响着肠道微生物群落的组成和功能特性。
本文研究了不同饮食条件下控制食物的组成以调节小鼠模型的肠道菌群情况，将含有4mg/mL的结核分枝杆菌H37Ra的CFA MOG35-55多肽皮下注射小鼠胸腔外侧，分别在0天和2天后注射200ng百日咳毒素，观察小鼠体征，进行阶段评分。深度麻醉后，脱臼或者灌注处死4分的小鼠，计算每只小鼠的临床EAE分数总和。另外，对小鼠进行免疫，9-11天后分离皮细胞和淋巴细胞，用10µg/ ml MOG35-55体外再刺激3天，诱导TH17细胞极化，使用负消耗富集CD4+T细胞，评估临床症状。随后用的蛋白质含量丰度的食物饲喂小鼠，免疫前，所有小鼠饲喂1-2周，定期监测体重减轻量，如果不超过30％，进行腹腔注射补充剂。分离脾脏，LN和CNS中的淋巴细胞，应用细胞滤网获得单细胞悬液，对深度麻醉的小鼠进行心脏PBS灌输，分离中枢神经系统浸润的淋巴细胞，染色，进行流式细胞术检测。通过电喷雾电离串联质谱（ESI-MS/MS）测量血浆中的氨基酸和皮质酮浓度，并将小鼠血浆样品置于冰上解冻，取30µg获得的上清液注入HPLC进行分析，最后使用Chromeleon™7.2色谱数据系统分析获得的结果。
结果显示，色氨酸作为一种必须氨基酸可以消除多发性硬化症小鼠模型中的中枢神经系统自身免疫，食物中的色氨酸限制会导致促脑炎性T细胞反应受损，并伴有轻度的肠道炎症反应和肠道菌群的明显表型转移，色氨酸对无菌小鼠的几乎无保护作用。结果表明，饮食中色氨酸的限制会改变肠道菌群的代谢特性，进而影响脑炎性T细胞反应。肠道菌群，饮食色氨酸和适应性免疫之间的这种联系可能有助于制定预防自身免疫性神经炎症的治疗策略。
论文ID
原名：Dietary tryptophan links encephalogenicity of autoreactive T cells with gut microbial ecology
译名：饮食色氨酸将自身反应性T细胞的脑源性与肠道微生物生态联系起来
期刊：Nature Communications
IF：11.878
发表时间：2019.10.25
通讯作者：Michael Platten
通讯作者单位：德国癌症研究中心＆德国海德堡大学曼海姆医学院
实验设计
结果
1 EAE诱导需要饮食中的色氨酸（trp）
当小鼠接受无蛋白饮食时（图1a），EAE的临床体征消失了（图1b）。另外，蛋白质含量降低的饮食（与对照饮食中的20％相比，减少了5％）不会影响EAE疾病的严重程度（图1c）。氨基酸谱分析表明，DPR诱导血浆中的缬氨酸，亮氨酸/异亮氨酸，蛋氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸，trp和精氨酸水平显著下降，trp显著降低（图1d）。
从饮食中去除trp足以在临床上模拟DPR的保护作用（图2a）。虽然EAE疾病的严重程度在雄性小鼠中更为明显，但DTR的保护作用与性别无关（补充图1a），这不能归因于必需氨基酸，因为饲喂无蛋氨酸（无蛋氨酸）食物的小鼠会患上发生疾病（补充图1，1b，c）。血浆氨基酸谱分析表明，DTR诱导免疫后16天，血浆水平的trp显着下降了50-60％，降至约20 µM（图2b）。DTR缺乏是EAE的关键标志，例如血脑屏障（BBB）破坏（图2c），白细胞，T细胞或巨噬细胞浸润或脱髓鞘（图2d-g，补充图1d）。
为明确DTR诱导的作用是否取决于口服给药途径。将经髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白（MOG）免疫的小鼠接受无trp饮食9天，并且未表现出任何临床EAE征象。当再次恢复trp口服时，这些小鼠出现临床症状，时滞为10天（图3a）。相反，通过每日腹膜内注射进行全身补充不能挽救DTR的表型（图3b）。这表明，trp是诱导自身免疫性神经炎症所必需的。此外，接受无trp饮食的小鼠血浆中的皮质类固醇水平并未显着升高（补充图2a），表明自身免疫性神经炎症的消除不是对DTR的非特异性应激反应的结果。
针对饮食中的trp能否激活和引发抗原特异性T细胞响应研究发现，诱导初期的DTR对于保护免受神经炎症至关重要，因为免疫后第5天开始接种DTR的小鼠会发展成EAE，而免疫后第2天的DTR则可以预防疾病（图3c）。在免疫当天开始的DTR减少了脾脏和引流淋巴结（dLN）中所有CD45 + T细胞的绝对CD4 + T细胞数，相对频率不变（图3d，补充图3a）。在无饮食情况下，仍会产生MOG反应性CD4 + T细胞应答（图3e，补充图3b）。IL17A缺失，但离体肽再刺激后IL-10分泌减少（图3f，g）。综上，表明DTR在系统性自身反应性T细胞中诱导了明显的表型变化，从而阻止了致脑炎性T细胞的形成。
从小鼠经DTR转移过来的MOG反应性T细胞完全有能力在离体刺激后诱导神经炎症（图3i，补充图4h–j）。相比之下，在完全饮食中在小鼠中引发的MOG特异性CD4 + T细胞过继转移到受体DTR小鼠中后，EAE变钝（图3j）。另外，用DTR小鼠血浆对活化的T细胞进行预处理会导致损伤向小鼠脑微血管内皮细胞（图3k）建模的离体BBB的迁移，这表明DTR小鼠中的可溶性因子会干扰T细胞迁移到CNS中。
这些结果表明，饮食中的trp对于启动MOG反应性T细胞是必不可少的，但是DTR通过减少循环的MOG35–55反应性活化的CD4 + T细胞的数量，改变表型及其迁移特性来发挥其作用。这种影响是可逆的，并依赖环境变量驱动。
图1 DPR防止诱导
图2 DTR抑制EAE
图3 DTR干扰T细胞的活化和迁移
2 DTR介导独立于GCN2和AHR的疾病保护
当饲喂无蛋白（图4a）或无trp食物（图4b，补充图5d–f）时，Gcn2-/-小鼠对EAE的抵抗力与野生型小鼠相同，这表明宿主GCN2不能通过DTR保护小鼠免受EAE。
血浆中的全身性5-羟色胺浓度在DTR小鼠中并基本不变（补充图5i）。小鼠与活性5-羟色胺前体5-羟色氨酸（5-HTP）一起重建，发现5-HTP拯救并不能逆转DTR诱导的表型（图4c）。此外，DTR小鼠补充吲哚-3-醛（I3A）或吲哚-3-甲醇（I3C），AHR9、19、36的激活配体或遗传性Ahr消融均不能破坏DTR小鼠对EAE的抵抗力（图4d，e），表明宿主AHR信号不作为观察到的DTR效应的感测机制。
检测DTR饮食对EAE的抗性是否取决于肠道微生物组发现，GF DTR和对照小鼠均易受EAE诱导的影响（图4f），但DTR小鼠的累积评分较高，但仍显着低于对照组，说明存在部分微生物群依赖性作用。尽管在饲喂无trp饮食的GF小鼠中T细胞和巨噬细胞的浸润较少（图4g，h），但在疾病高峰期两组的脱髓鞘作用均相同（图4i）。与先前在无特定病原体（SPF）条件下的发现一致，在GF小鼠中，DTR血浆水平响应DTR而显着降低（图4j）。这些结果表明，肠道菌群在防止中枢神经系统浸润对DTR的脑致病性T细胞方面起着决定性的作用。
3 DTR塑造结肠肠道菌群组成
DTR在结肠中引起了轻度炎症，其特征是白细胞侵袭增加和淋巴滤泡积累增加（图5a，补充图6a）。两组中的黏膜免疫细胞浸润均以巨噬细胞，B细胞和CD4 + T细胞为主，DTR小鼠的B细胞区室收缩。
另外，微生物组16s RNA测序显示，DTR的微生物α多样性和β多样性分析在各自的主坐标分析（图5b）中显示出实验组的不同聚类。在门系水平上，对DTR的反应可检测到属于拟杆菌科的细菌类群和疣微菌，而放线菌，变形杆菌和硬毛菌的相对丰度增加。对DTR的反应引起的分类学变化，发现阿克曼菌，乳杆菌和巴氏杆菌有所减少（图5c）。从微生物群落的预测功能分析，推断DTR诱导了肠道微生物系统发育的改变，这可能随后影响关键的代谢途径，例如氨基酸合成（图5d）。在回肠或结肠中，腔内trp水平无显着下降，而血浆浓度受到了影响（图5e）。trp的全身吸收通常是近端小肠的功能，因此肠下部的trp腔水平很可能与血清水平脱钩。
综上所述，这些结果表明DTR对肠道菌群组成影响深远，随后影响代谢途径如氨基酸的合成。
免疫后14天从结肠粘膜进行了RNA测序，并分别鉴定了1237和1260个DEG，它们分别响应DTR上调和下调（图6a，b，补充数据5）。利用基因本体论进行的正式基因集富集分析显示，涉及先天和适应性免疫应答调节以及抗原加工的转录本显着下调，而神经元发育和信号传导的关键过程响应DTR而上调（图6c，d，补充数据6和7），表明DTR作用于免疫细胞的活化。转录本中的保守转录因子结合位点（TFBS）分析结果显示，转录因子aMEF-2，Deaf1，Cdx2，Egr1和Tbp的结合位点在上调基因中位居前列，而Etv4，AML1 / Runx1和Ets1的位点在下调基因中位居前列（图6e，补充数据8和9）。TFBS的分析显示了丰富的B细胞内在因子，也暗示了T细胞调节过程，例如：下调Ets1和Runx1。
综上，参与神经元信号传导和发育的通路的清晰信号揭示了膳食trp在调节肠脑轴中的潜在作用。尽管结果没有直接表明肠道菌群与宿主免疫系统之间的串扰如何介导DTR对EAE发育的保护作用的明显机制，但数据显示了对肠道粘膜局部免疫反应的深远影响，并提供了起点以便将来研究。
图6 DTR调节结肠粘膜的关键分子信号通路
讨论
本研究证明饮食中必需氨基酸trp的缺失足以抑制鼠源性T细胞反应，并在鼠MS模型中预防CNS自身免疫。虽然未检测所有必需氨基酸，但蛋氨酸限制不能改变EAE的临床病程，这与必需氨基酸剥夺的一般作用有关。连同其他研究，其中trp剥夺表现出DPR18的强免疫调节作用，这些数据突出了trp代谢在免疫抑制中的关键作用，并表明饮食中的trp是诱导中枢神经系统自身免疫所特有的。
在本实验中，trp的剥夺与体重减轻有关，这可能会触发非特异性的一般免疫代谢转变，从而影响自身免疫。但是，在DTR小鼠中均未观察到活性生长素释放肽或皮质类固醇的血浆水平增加，这表明短期无trp饮食不会诱导强烈的非特异性应激或饥饿信号。但是，DTR小鼠血浆瘦素水平显着下降，这在营养限制期间通常会观察到。施用瘦素会加重自身免疫性神经炎症反应，而用瘦素中和抗体进行治疗可改善小鼠模型中的EAE，这与抑制脑致病性T细胞有关。
Trp代谢具有多种免疫调节功能。因此，推测DTR对代谢物水平的改变可以解释所观察到的表型。饮食中的trp在哺乳动物肠道内通过两种不同的途径内源性代谢，即犬尿氨酸途径（KP）通过肠道免疫或上皮细胞中表达的IDO1以及通过血清素途径通过肠嗜铬细胞中表达的trp羟化酶（TpH1）。有几个报道显示饮食trp的内源性肠道分解代谢的因果关系：（1）外源施用5-HTP不能破坏DTR小鼠对EAE的抗性。（2）遗传消融是trp耗竭的关键传感器，GCN2不能破坏小鼠对DTR的抵抗力。（3）系统性trp重服无法克服DTR的保护作用。
本究的数据表明DTR对EAE的抑制作用取决于微生物群的存在，因为GF小鼠在EAE模型中不受益于DTR。DTR诱导的肠道微生物组发生了复杂的变化，这与其他研究结果一致，其中包括丰富的trp合成细菌属。当不存在饮食trp时，这种内源性调节变化可能会涉及此类细菌的竞争优势，这反过来也可能导致细菌trp分解代谢物水平发生变化，例如：通过色氨酸酶-吲哚途径。已知这些分解代谢物通过AHR途径在包括EAE在内的各种实验环境中发挥过多的免疫调节功能。例如，trp来源的微生物代谢物可将AHR靶向星形胶质细胞和小胶质细胞。此外，系统性施用合成的trp代谢物可激活AHR53，从而抑制小鼠自身免疫性神经炎症。但是，在本实验模型模型中，既不进行遗传消融，也不补充AHR激活的吲哚来调节DTR的抑制作用。另外，当使用具有组成性AHR缺失的小鼠模型时，不能排除不同细胞群体中AHR的相反功能可能导致这种受体缺失效应的缺乏。
本研究采用的DTR方案有明显的结肠炎症反应，同时肠道微生物生态学发生了变化。干扰肠道稳态会影响全身免疫力，肠道外T细胞的数量和表型是由肠道微生物组决定的。本研究表明，DTR不会影响MOG反应性T细胞的启动，但会通过减少循环的MOG35–55反应性活化的CD4 + T细胞的数量及其迁移特性而发挥作用。外周MOG反应性T细胞的转录组分析也显示出改变的表型，响应DTR的Il2ra，Il2rb，Nptn和弗林蛋白酶mRNA水平增加，而Il10ra和Crcp表达水平降低。响应DTR的IL-2R转录本的诱导与MOG反应性T细胞的明显过度增殖表型兼容。缺乏Nptn的CD4 + T细胞显示出增强的TCR介导的细胞因子产生，这表明Nptn限制了T细胞的活化。
本研究的结果发现鉴定抑制自身反应性T细胞反应的必需微生物物种和trp代谢产物时必要的。揭示DTR诱导的T细胞内在信号传导途径中的改变，这些改变会干扰致脑炎性免疫细胞的形成和迁移，并验证患者的关键发现，将有望把本研究发现转化为治疗MS患者的治疗方法。
结论
评论
肠道中宿主与微生物群的相互作用受损，可能导致全身性T细胞反应失调，导致远处器官的自身免疫性疾病，本研究首次利用缺乏色氨酸的食物来饲喂小鼠以验证营养成分对肠道微生物群的组成和功能特性的影响，结果显示色氨酸可以消除多发性硬化症小鼠模型中的中枢神经系统自身免疫，表明饮食中色氨酸的限制会改变肠道菌群的代谢特性，进而影响脑炎性T细胞反应。
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