综述 | 植物微生物群的研究机遇：建立因果关系
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导 读
植物微—生物群的研究强调了本地微生物群落对宿主表型如生长和健康的重要性。其目的是发现宿主—微生物和微生物—微生物相互作用形成和维持微生物群落的分子基础，并了解单个微生物群的作用及它们的集体生态系统功能。作者从还原主义方法的视角综述并展望了如何利用控制实验，以解开植物—微生物群相互作用的内在复杂性。
论文ID
原名：Establishing Causality: Opportunities of Synthetic Communities for Plant Microbiome Research
译名：植物微生物群的研究机遇：建立因果关系
期刊：cell host & microbe
IF：17.872
发表时间：2017.8
通信作者：Vorholt
通信作者单位：Institute of Microbiology, ETH Zurich, Switzerland
综述目的
通过综述自己的认知，提出微生物-微生物和植物—微生物群当下的研究机遇：建立因果关系。（这种因果关系是通过合成群落建立的，即，通过替换属于相同操作分类单元或生态型的菌株，可以测试单个菌株的效果，最后证明这些菌株是否表现相似，群落产量是否稳健，个体样本是否可互换并且被用来理解哪些微生物—微生物及植物—微生物组合会导致递增效应或冗余效应等。）
综述内容
引言
植物微生物群的研究强调了本地微生物群落对宿主（植物）表型如生长和健康的重要性。其目的是发现宿主—微生物和微生物—微生物相互作用形成和维持微生物群落的分子基础，并了解单个微生物的作用及它们的集体生态系统功能。微生物、宿主（植物）和环境参数的修改可以通过动态的和不同空间尺度的去定量评估宿主和微生物特征。
自然环境，包括动物和植物，为微生物提供了大量的生态位，使多种菌株能够共存并形成复杂的微生物群落。每个多细胞宿主及其微生物群都可被视为超/有机体或全息生物（大量的全息生物现象告诉我们，生物体的整体由部分组成，部分在结构和组成上与整体相似，含有整体的全部信息）。尽管各种宿主—微生物系统（包括陆生植物）明显不同，但关于宿主—微生物的性质和微生物—微生物相互作用的概念上类似的问题是可以解决的;例如，了解微生物群在宿主适应性方面的功能，以及这些功能是如何实现的。将宿主生物体及其微生物区系视为全息生物，拓宽了宿主—微生物相互作用的更为传统的观点，即宿主—微生物相互作用的中心是具有威胁性的病原体或特定的植物—微生物共生体，如固氮细菌或使磷酸盐流动的菌根。
植物微生物群
图1 植物微生物群的层次和数据生成及分析的机会。最上面的一层(全息生物)代表生物体的层次，表示与植物有关的植物、细菌和其他微生物。中间层（宏基因组）代表宏基因组，包括遗传信息的全部，即植物和所有微生物的基因组。下层（转录组，蛋白质组，代谢组）代表生物体（植物和微生物）的分子水平，其由由转录组，蛋白质组和代谢组构建的网络组成。有针对性的操作和分析的选择是有代表性的，除时空研究外，还包括各种层次以及非生物和生物环境因素。[图中红色中文为编译者添加]
新一代测序技术的最新进展标志着一个新时代的开始，即收集来自不同宿主的微生物群落的遗传信息。该策略为了解一个群落中不同系统发育群体的相对丰度及其成员的代谢和生理潜力提供了见解。由于随机事件的存在，一些微生物可能是偶然出现的; 然而，越来越多的证据表明，核心微生物不仅在门水平上，而且在更高的分类分辨率上，跨空间、时间和部分跨器官，在健康植物上建立一致和可复制的系统。虽然单个门、类或属的相对丰度可能不同，但至少部分是由于环境和植物基因型的变化所引起的。而近些年来的独立培养研究数据表明，微生物群落并非随机聚集，而是年复一年地以类似的模式建立。
正因为相关的微生物群有助于宿主（植物）表型的显现，所以了解宿主（植物）相关微生物群落结构形成和功能潜在的机制尤其重要。已知植物有益和/或微生物介导的特征的实例包括植物保护、大量元素获取、抗旱和耐盐碱以及开花时间。由于这些表型影响生殖健康，因此我们似乎可以合理地假设，植物通过先天或诱导、刺激或抑制活动，根据其关键功能能力，进化出吸引和维持微生物种群的机制，从而与其相关的微生物共同进化。
从以前的研究来看，植物保护的研究只集中在少数几种病原体和有限的有益微生物的选择上(例如荧光假单胞菌群)。因此，重要的是要将植物保护和其他植物表型(如营养获取)的分析扩展到整个植物微生物区系，不仅是单一的菌株，而且是一个群落。从系统的角度来看植物，其强调了需要将植物及其相关微生物区系的专业知识结合起来的必要性。它需要在经典学科边界的交界处进行研究，不仅要研究和解释微生物(古菌、细菌、真菌和卵菌类)之间以及植物和微生物之间的相互作用，还要研究与病毒、食草动物和环境因素之间的相互作用，统称为植物生物组。
还原主义方法的挑战和目标
植物—微生物相互作用的研究目前正通过解决从生物体到分子水平的这种相互作用的复杂性而达到新的维度(图1)。虽然通过各种方法(如16S rRNA基因扩增子测序或全基因组猎枪宏基因组学)生成测序数据的目录是很容易完成的，但是阐明微生物群落组装、动力学和恢复/抗性所涉及的生物学机制，以及建立微生物群和植物表型之间的因果关系尚不明确。解决这些基本原理具有挑战性，并且需要实验方法，其允许可重复的条件和对所选因子的靶向修饰，以鉴定遗传或分子水平的变化并将其与宿主和群落表型联系起来（图1和2）。可调整的因素包括，例如，特定微生物或群体的存在/缺失和数量，各种微生物引入的顺序，特定菌株或宿主的遗传改变，以及生长条件。对于植物来说，除了昆虫等生物因素外，可调节的环境因素还包括土壤类型、温度、湿度、光照强度和质量。对所有这些参数进行充分的控制，将使混淆因素最小化，并有助于对结果的解释。此外，通过使用适当的控制和有针对性的操作技术，可以降低宿主基因型、微生物组基因型和环境所提供的内在复杂性，从而建立因果关系，最理想情况是通过整合构成植物微生物组的所有层(图1)。
图2 植物微生物群落研究中的合成群落实验概念。菌株收集是从植物材料中产生的，并储存起来供进一步研究。基于感兴趣的研究问题，通过产生自下而上的微生物菌株混合物来设计合成菌群，然后用于接种在所选受控条件下生长的选定基因型的植物。确定并分析感兴趣的读数。建模可以帮助解释数据，也可以帮助设计未来的实验。总的来说，这便产生了对微生物组功能的更深入理解。这些知识应该有助于指导生物学在农业中的下一代应用。[图中红色中文为编译者添加]
显然，任何实验装置都必须经过精心设计，才能恰当地解决感兴趣的问题。生成的数据可能包括对群落组成和丰度的定量评估、整个基因组库、转录或蛋白质组水平上的基因表达谱、原位代谢物检测以及不同尺度上的空间信息，理想情况下，所有这些都是动态的。
实验植物微生物组系统一方面可以依赖于复杂的没有特征的微生物群落，从而为使用自上向下方法隔离负责表型的关键成员提供了一个良好的起点。例如,这种策略最近被用来识别细菌家族，这可能有助于一种特定土壤对根致病性真菌根霉表型的疾病抑制，从而对早期在抑制土壤上的发现进行了后续研究。另一方面，完全合成的微生物群落可以以自下而上的方式使用(图3)。后者需要收集培养本地的微生物，其允许在生殖条件下重建合成群落，这种环境虽然是人工的，但能够尽可能地模仿自然环境或其特征。本文重点讨论第二种方法——合成群落。
合成微生物群落的方法
根据定义，合成系统是为了某种目的而由人工构建组装而成的，即，模仿天然产物。转化为植物微生物群，合成群落或构建的微生物群是通过使用自下而上组合混合选择的菌株并将其应用于植物以研究植物微生物相互作用的各个方面而设计的微生物群落，目的是发现基本原理并生成知识可以转化为被农业应用（图2）。该系统的一大优点是它允许在受控和可重复的条件下对其组分进行详细研究，促进基因型和表型之间的因果关系的建立。然而，合成群落方法的真正优势在于其可以在菌株水平上添加、消除或替代生物。此外，不仅可以在生物层面上实施变化，也可以在功能层面上实现，在功能水平上可以例如通过基因表达或原位沉默来特异性地去除或添加各个功能。扰动的后果(生物或非生物的)可以在所有不同的水平上进行监测(图1)，这对于理解单个微生物在群落环境中的作用是至关重要的。要最终理解群落生态学的基本原理，需要整合不同的读数、修正假设和仔细的实验设计(图2)。
与自然群落相比，人工合成群落的复杂性天生较低(图3)。因此，有人可能会说，因为它们可能会漏掉重要的群落成员，所以其并不能代表一个天然植物微生物组的完全复制品。这是正确的，因为它代表了这种方法的局限性。此外,许多不同的因素同时作用，简化的实验系统不能完全代表环境的异质性的全部范围。然而，作为一种通过有针对性的操作发现因果关系的方法，降低复杂性的系统是实验的先决条件。即使这些降低了复杂性的系统不能完全模拟自然，但是它们允许重新表达微生物介导的表型，这些表型可以在其他群落中进行进一步测试，并/或用于搜索其在环境样本中结构/功能的关性，以展示超出特定实验设置之外的一般原则。
图3 与微生态实验相比，植物微生物学研究中低复杂性和高复杂性合成群落在的优势和局限性。使用合成群落的重建实验旨在通过改变给定混合物的组成和/或功能能力来建立因果关系。合成群落可以模拟自然的复杂性，更高多样性的群落具有更高、更自然的代表性，从而降低了微生物组(GM)基因型所提供的关键生物体和功能缺失的固有风险。在各种多样性水平的合成群落实验中实现了实验的可重复性，且随着随机事件的最小化，低等多样性群体在实验可重复性方面尤其高。可追溯性是建立表型—基因型关系的分子基础所必需的，因此，低多样性群落促进了因果关系。
微生物的培养搜集、基因组和无菌的前提
微生物的综合培养收集是建立合成群落的先决条件。是否具有代表性是一个关键问题，也就是这些微生物集合在多大程度上代表了自然种群，且其本质上是很难实现和确定。对于评估来说，参照环境样本的直接测序方法进行交叉参照非常重要。这种基准通常可以根据细菌的16S rRNA基因序列和真核生物的18S rRNA基因的内部转录间隔物，根据分类单元生成，然后将序列聚类成可操作的分类单元(OTUs)。为了建立微生物菌株的收集模型，重要的是要涵盖尽可能多的物种(理想情况下，所有构成一个核心微生物群的环境样本)，并包括来自每个物种的多个样本。
菌株收集需要从不同的植物器官(叶、根、花和种子)、从包括作物在内的各种植物物种（例如小规模的收集从模型生成的豆科、苜蓿和玉米）和在不同条件下生长的植物中产生;例如，土壤肥力差别和不同的气候。这种小规模的菌种收集可以很容易地与独立培养的群落研究并行进行，且其依旧是后续研究的宝贵资源。到目前为止，菌株收集主要集中在细菌上；但是，为了具有广泛的代表性，需要将栽培工作扩展到包括真菌、卵菌、古生菌以及一些植物，以反映植物的微生物多样性。
扩大培养集不仅可以增加与天然菌群的相似性，促进合成菌群的研究，而且本身就是一种极有价值的资源。全面的菌种收集将有助于筛选单个菌种特征的生境，例如生产新的天然产物。二元微生物—微生物交互作用的分析有助于确定有益的和有害的关系,有助于生态位的分离, 而微生物—植物相互作用筛选则是为识别具有宿主疾病保护或促进生长潜力的菌株提供了一个强有力的机会，这些方面将在群落背景下进行测试。微生物基因组序列构成了培养集，将增强独立于培养的群落分析以及蛋白质组学、转录组学和代谢组学等功能基因组学方法的数据集成。此外，基因组数据库可以挖掘特定性状的微生物栖息地，并比较单个分离株或分支之间的基因组。
为了扩展植物和相关微生物的生物工具箱，生殖系统需要进一步的调整。一些模型系统已经出现在实验室植物生长和分析二元或复杂的植物-微生物相互作用。这些范围从洋红盒、微盒、多孔板的琼脂培养基培养条件，到煅烧粘土作为惰性土的替代品，再到高压蒸汽处理过的土壤。然而，包括光的质量和数量、紫外线辐射、温度、湿度和植物密度在内的多个因素可能需要进行调整，以便设计更加天然的生物模型系统，忠实地模拟环境条件，并促进将实验室获得的观测结果转换到实际应用。
微生物群的设计
合成群落是从个体微生物培养物自下而上构建的，并且允许解剖不同菌株在更加复杂性的相互作用网络中所起的作用（见上文）。这种实验方法能够对单个菌株、种群或功能进行特定的去除(退出)或抑制，并监控整个系统的响应。此外，还可以通过将个别菌株引入预先建立的群落来测试它们的入侵性和优先效应，从而提供对群落集会的历史偶然性的见解。此外，通过改变植物基因型和使用相同的微生物群落，可以确定特定植物基因在群落中的功能(有关大量潜在实验设计选项的示例插图，请参见图4)。
图4 植物微生物群研究中重组实验的典型设计方案和读数。构成用于假设检验的合成群落的策略包括基于系统发育、分类、相互作用网络或特定功能选择的菌株（或突变体）。可以修改实验设置，以测试植物基因型或环境因素的影响。各种读数可用于分析相对和绝对群落变化或植物表型。[图中红色中文为编译者添加]
可以在现有可用的菌株收集提供的约束范围内设计具有一定复杂性的合成社区系统。虽然低复杂性系统有助于测试单个菌株所起的作用，但它们可能会错过通常在环境条件下发生的微生物相互作用网络中的关键节点（图3）。随着社区复杂性的增加，忽略重要群落功能的机会减少;然而，正如前面提到的，即使是高度复杂的社区也可能会遗漏关键要素。
通常，为了尽可能自然，人工合成群体应在采用16S / 18S rRNA基因作为参考时要模拟相应的不依赖于培养物的群落，即使由于在操作分类单元内存在变异，但是将操作分类单元转化为菌株仍然是困难的。因此，为每个操作分类单元选择多个菌株是一种自然选择;然而，这需要生物信息学管道能够可靠地识别出低于经典操作分类单位定义(97％序列同一性)的密切相关菌株。例如，与植物相关的假单胞菌分离株会导致植物表型从有益到有害不等，甚至在物种内部也是如此，这就强调了将系统发育与生理学关联起来的困难。然而，最终，通过替换属于相同操作分类单元或生态型的菌株，可以测试单个菌株的效果，最后证明这些菌株是否表现相似，群落产量是否稳健，并且个体样本是否可互换。
与建立基于系统发育的合成群落相反，相应的基因组序列和基因表达谱可以帮助基于功能能力来设计微生物群;例如,预测代谢能力或合成天然产物的潜力，包括可能潜在地塑造微生物群落结构的信号分子或抗生素，包括可能形成微生物群落结构的信号分子或抗生素。并且，合成群落可能会被用来理解哪些微生物组合会导致递增效应或冗余效应。
在设计合成群落实验时，还需要仔细考虑其他更实际的方面:菌株是在液体培养基中培养还是在固体培养基中培养?在实验前菌株应该生长多长时间?所有菌株之间是否应该以相同的比例混合，如果是这样，那么如何准确测量该比例(如光学密度、细胞计数、体积)? 如何将合成社区引入植物宿主？如果技术不能保持一致和准确，这些实验问题可能导致截然不同的结果，减少重复性和解释。
分析和读出以建立因果关系
宏基因组关联研究被广泛用于植物基因型与表型的关联，并已被应用于植物微生物组分析。在未来，宏基因组（微生物组）全关联研究可能会产生令人兴奋的观点来建立因果关系，解释为什么某些菌株与感兴趣的植物表型相关。在植物基因组测序的菌株收集试验中，无论是在单关联还是作为多种不同微生物组组成的合成群落实验，都将为将单个基因或单核苷酸多态性与宿主表型关联提供有价值的基础;这样的关联可以通过基因型-表型相关性的实验测试来验证这种关联。
植物表型是一个重要的读数，提供关于芽或根生物量，大量元素（例如磷）含量，碳氮比，光合活性，疾病指数等的定量数据。专用平台具有监测宿主侧各种参数以补充微生物组与植物表型关联的巨大潜力。最近的技术进步通过机器人辅助成像平台和非破坏性方式的自动图像分析（植物表型组学）提高了产量，特别适用于上述某些参数的叶际间的调查。测量土壤中的根系生长更加困难，并且已经使用了人造土壤替代品或琼脂系统。特别是层析成像方法为研究根生长或结构提供了新的机会。
模型建立与测试
微生物生态系统建模是提高我们对微生物群落动态认识的一个重要领域。然而，建立基于群落结构的微生物区系功能预测数学模型仍然是微生物生态学中的一个关键性挑战。微生物-微生物和植物-微生物之间的相互作用存在于一个从正到中性到负的连续体中，并依赖于环境。由于同时发生多种相互作用，整个系统的稳定性和动态性很难通过实验和计算来捕获。实验研究与模型设计的紧密协调将促进数据的整合，这是提高微生物群动态和功能的预测能力所必需的。最近的研究表明，其可以利用基于简单装配规则的模型，分别根据成对或三方竞争的结果预测细菌之间的三向竞争或七至八向竞争的结果。共现相互作用网络允许演绎生态预测，包括代谢相互作用、群落的抗性和稳定性(反之亦然，群落的脆弱性)，以及关键物种或基因的识别。
网络推理可以帮助建立可测试的实验来支持已建立的模型或证明其是虚假的。因为微生物群，无论是作为单独的菌株还是作为它们相互作用的总和，都会改变其栖息地，并在植物宿主中引起反应，因此需要作出重大努力来建立包括环境因素在内的整个系统的模型。另一个挑战是在细胞生物化学的机械水平和生物丰度水平之间架起桥梁。另一个挑战在于将有机物丰度水平与细胞生物化学的机械水平联系起来。但是，这将为应对具有可预测结果的复杂群落工程的挑战奠定基础，并在改进模型时需要整合的信息缺失方面提供指导。
植物有益表型的微生物组工程
本土微生物群影响植物特性，例如营养状况，生物量的产生和对生物或非生物胁迫的抗性等。因此，可以通过人工微生物组的选择来选择微生物群落，从而获得对植物具有优良性能和服务的植物微生物区系。然而，需要注意的是，进化后的群落也可能会影响到其他植物物种，因此并不是特定的。
以覆盖该植物大部分菌种的综合菌种收集为起始接种点，结合生殖条件，将对微生物组选择实验具有很高的价值。尽管它们可能遗漏了植物微生物组的某些部分(见上文关于菌种收集的讨论)，但合成群落是易于处理的，有助于通过对选定的或经过进化的菌株进行下一代测序来重新测序以进行选择，从而了解导致植物表型改善的原因。例如，有可能确定观察到的差异是否仅通过不同细菌物种的相对丰度的变化来解释，或者更可能的是，遗传变化和个体成员的基因表达谱的改变是否是造成群落变化的原因，进而是造成植物表型改变的原因。
来自合成群落实验的首次思考
利用合成群落研究植物—微生物的研究还处于起步阶段。然而，由于伴随的基因组序列可公开获得及组织内部菌株收集，可以预期该领域将会快速发展。合成群落实验也被用于对微观世界实验中的观察进行跟踪，从而将复杂自然群落中的假设性检验与在更加受控条件下进行的研究联系起来，从而允许在较低的分类水平上进行读数。将合成群落与自然的、复杂的群落混合进行的实验有助于测试简单群落在复杂环境中的行为方式。
总体来说，这些合成群的落研究展示了合成群落实验的潜力，并强调了它们在揭示微生物—微生物及植物微生物组相互作用方面的价值。它们还提供了将纯粹的合成群落与环境条件联系起来的第一个途径。
总 结
由于生物系统固有的复杂性，使得人们很难理解塑造微生物群落的因素，特别是在植物生长和健康的背景下。这些因素强调，除了植物和微生物之间的相互作用外，还需要研究和解释微生物之间的相互作用，以作为表型分析的基础。需要基于多物种实验系统的研究来揭示微生物相互作用和决定植物群落结构和功能的重要机制。合成群落实验不是环境研究的替代品，而是旨在发现驱动自然条件下观测的分子基础，并将其转化为可测试系统的补充。反之亦然，从合成群落研究中收集的机制见解随后可以在温室和野外实验中验证其转化的潜力。
参考模型系统对于建立观察到的表型的因果关系具有很大的潜力。他们不是从单一的角度来研究植物微生物群落，而是从多方面的角度来研究。互补的经验方法将涉及在有机和分子水平上对细菌和植物侧面的修改，并将导致的发现同时交互发生在许多实体(图1)。改善作物生产的策略可能包括由繁殖的植物选择有益微生物或直接实施有针对性的遗传工程策略。
最后，我们的目标不仅是要提高对还原论方法中出现的基本原理的理解，而且要将这些知识转化为农业（图2）。理解植物—微生物核心功能可能有助于克服当前的一些局限性,如使用生物防治菌株时的不一致性，解决耐药机制。此外，利用合成群落作为生物制剂的新战略为建设可持续的下一代农业提供了机会。
编译者的个人思考
①文章综述者的idea新颖：微生物、宿主（植物）和环境参数（实验因子）的修改可以通过动态的和不同空间尺度的去定量评估植物及微生物的特征。作者以超前的视角提出利用还原主义的方法可以验证植物—微生物群耦合特征的假说，然后通过对植物—微生物群在实验上易于处理的合成群落实验进行归纳分析，最终解释了自己提出的假说：通过在繁殖系统中进行有针对性的操作来建立植物—微生物群表征的因果关系。
②对于植物—微生物的研究，目前各学者均关注于根际和非根际微生物的动态变化。目前有一个趋势，即，实验者在测试微生物指标时，不能单一的测试某个微生物群（或者某个、某几个菌株）的数量，更要测试其功能基因是否表达了。为什么要这么做？因为，微生物数量指标只能说明哪类微生物较多，哪类微生物数量少。但是，你要明确一点，如果数量多的微生物可能参于管控的功能基因并不一定表达，而数量稍微少的微生物参与管控的功能基因一直处于表达状态，那么此时数量少的该类微生物较数量多的微生物重要的多。所以，这也是为什么目前测试功能基因是否表达的指标成为大家的钟爱的重要原因之一了。
③宏基因组关联研究目前正被广泛用于植物基因型与表型的表达研究，并已被应用于植物—微生物群的分析。在未来，宏基因组（微生物组）全关联研究可能会产生令人兴奋的观点来建立因果关系，解释为什么某些菌株与感兴趣的植物表型相关。
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