科研 | ISME：宏基因组和宏转录组学揭示新目deltaproteobacterial的生态功能
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在极端富铁和富硫环境中存在多种未培养的微生物，在铁和硫元素的生态循环中发挥着重要的作用，但是它们的生物多样性和生态功能并不清楚。本研究从酸性矿山(AMD)样本中重组出四个宏基因组组装基因组(MAGs)，该四个基因组属于新deltaproteobacterial目，命名为Candidatus Acidulodesulfobacterales。通过统计该目在不同地区样本中的相对丰度以及与样本理化指标的关系发现：该目的相对丰度与二价铁的含量密切相关。进一步地，通过重构代谢通路发现该目属于兼性厌氧微生物并具有固氮功能。该目同时具备氧化硫化物和还原硫酸盐的功能，其功能的方向受氧气控制。另外发现与铁代谢相关的基因存在和表达，证明在铁循环中具有潜在的功能。同时在体系中发现该目的微生物可以表达大量的抗性基因，揭示了该目应对极端环境的代谢机制。总而言之，本研究揭示了自然界中deltaproteobacterial目的分布、多样性和潜在的生态作用。
论文ID
原名：Insights into ecological role of a new deltaproteobacterial order Candidatus Acidulodesulfobacterales by metagenomics and metatranscriptomics
译名：基于宏基因组和宏转录组学揭示新目deltaproteobacterial-Candidatus Acidulodesulfobacterales的生态功能。
期刊：ISME Journal
IF：9.493
发表时间：2019.5
通讯作者：Hai-Liang Dong和束文圣
通讯作者单位：迈阿密大学和华南师范大学
实验设计
本研究收集了人工构建的夏天-冬天-夏天的季节性酸性矿山样本(S1-S5)，S1采样时间为2016年7月，S2采样时间为8月，S3采样时间为2016年12月，S4采样时间为2017年2月，S5采样时间为2017年8月。本研究对五个样本分别进行宏基因组和宏转录组测序，基于宏基因组分箱技术(MetaBat)获得重组宏基因组组装基因组，通过NCBI-nr、KEGG、eggNOG数据库注释获得各自基因的注释信息。结合重组基因组构建代谢网络，结合宏转录组揭示重组基因组所对应微生物的生态位功能。
结果和讨论
1. 变形菌纲中的新目：Ca. Acidulodesulfobacterales
本研究在5个样本中共获得434Gb的宏基因组数据。在5个样本中均发现Sva0485分支微生物的存在(一类具有还原硫酸盐和铁离子的微生物分类)，其相对丰度在4.7-61.5%之间(图1b)。通过宏基因组分箱技术共获得4个重组基因组(bins)，命名为AP1-4。与变形菌纲的微生物构建进化树结果显示AP1-4组成一个单独的分支，因此推测AP1-4可能为变形菌纲新目(图1d)，命名为Candidatus Acidulodesulfobacterales (Ca. Acidulodesulfobacterales)。4的bins的16S rRNA 基因序列的相似度在91-100%之间，OrthoANI值在70-80%之间(图1d)，因此将四种bins可分为两个属Candidatus Acididesulfobacter (Ca. Acididesulfobacter, AP1 and AP2) and Candidatus Acidulodesulfobacterium (Ca. Acidulodesulfobacterium, AP3 and AP4)。
图1 Ca. Acidulodesulfobacterales的重组基因组。a.采用地点，ESOM对四个重组基因组特征进行可视化。b. 不同时间点四个Ca. Acidulodesulfobacterales的相对丰度(分布基于宏基基因组和宏转录组)。c. 基于16S rRNA序列的系统发育树以及丰度分布规律。d. 四个重组基因组物种的系统发育位置以及16核糖体蛋白的相似度和orthoANI。
2. Ca. Acidulodesulfobacterales在酸性矿山环境中的生物地理学特征
为了进一步揭示Ca. Acidulodesulfobacterales的空间分布模式，本研究分析了59个来自中国东南地区的酸性矿山测序样本(图2a)。结果显示Ca. Acidulodesulfobacterales在其中49个样本中存在，其相对丰度为从0.03到45.4%。
两个属的分布广泛性和相对含量相似。多元线性回归结果显示Ca. Acididesulfobacter的丰度以及两个属(Ca. Acididesulfobacter和Ca. Acidulodesulfobacterium)与亚铁含量呈现相关，与酸度、硫、pH的相关性较低(图2b)。
图2 Ca. Acidulodesulfobactera的空间分布特征，a. Ca. Acidulodesulfobacterales在不同样本中相对丰度，b. 相对丰度与环境因子之间的相关性。
3. Ca. Acidulodesulfobacterales的基因组特征以及在人工构建的酸性矿山中的动态特征
四个bins基因组的基本特征如表1所示。它们的基因组大小在1.9-2.5Mb之间，完整度在92-94%之间，污染度均小于1%。与Ca. Acidulodesulfobacterium
(AP3 and AP4)相比，Ca. Acididesulfobacter (AP1 and AP2)的基因组较大但是GC%较低。预测基因的数量为1805-2208，在NCBI-nr数据库中的注释率为79-86%，在KEGG数据库中的注释率为79-89%，在eggNOG数据库中的注释率为66-78%。AP1基因组中含有较多的CRISPR位点，说明AP1与噬菌体之间存在更多的相互作用。
表1 Ca. Acidulodesulfobacterales基因组信息
4个bins的OrthoANI值在70-80%之间，说明具有不同的的代谢特征。根据KO的比较分析结果发现，4个bins共有870的共有KOs，AP1和AP2(Ca. Acididesulfobacter)之间存在939个共有KOs，AP3和AP4之间(Ca. Acidulodesulfobacterium)共有922个共有KOs。特异性的KOs的数量比共有的KOs的数量要少很对，AP1有59个，AP2有21个，AP3有41个，AP4有38个，说明四个种之间的基因组差异较小。尽管如此，本研究仅在AP1中发现尿素代谢，在AP3中发现氮氧化物还原代谢。这些特异性基因的存在有可能使得这些微生物避免竞争排异从而共存。
同时本研究恢复了属于其他属的57个MAGs(Proteobacteria，Euryarchaeota，Nitrospirae，Micrarchaeota，Parvarchaeota，Firmicutes, Actinobacteria)。在13个月里微生物的相对丰度发生着剧烈的变化，说明在不同的时间点，发挥功能的微生物也是不同的，该系统是个不稳定的系统。本研究进一步研究了13个月中四个Ca. Acidulodesulfobacterales物种的相对丰度和转录活性的动态变化，结果如图1b所示。Ca. Acidulodesulfobacterales的相对丰度在4.7-61.5%之间波动，除了在S5中AP2是优势物种之外(相对丰度9.4%)，AP4是其他时间点的优势物种(4.2-42.0%)。他们的转录活性与相对丰度的变化趋势相似，Ca. Acidulodesulfobacterales的转录丰度为7.5-70.6%，在S5时间点，AP4的转录活性最高(~4.0%)，在其他时间点，AP2的转录活性最高(6.4−67.1%)。
4. Ca. Acidulodesulfobacterales的代谢潜力
根据基因组信息，本研究揭示了Ca. Acidulodesulfobacterales的代谢潜力(图3)，并结合宏转录组进行支持。首先分析了前20个转录活性(RPKM)最强和相对转录丰度(RTA)最高的基因，其中10个基因在两种分布方式中均存在，这些基因与应激反应、鞭毛组装、运输、转录调控、氮固定和铁氧化有关，其余不一致的基因包括硫氨素代谢、甲烷代谢、乙醛酸和二羧酸代谢、硫代谢、脂多糖生物合成、纤毛组装、鞭毛组装、蛋白质运输、RNA降解和应激反应(图4)。在这20个基因中，AP4的基因转录活性(RPKM)均高于其他三个物种(P<0.05),但是基于RTA分析未发现该现象。接下来，对碳固定、氮代谢、硫代谢、铁代谢、氧化磷酸化、发酵和应激反应代谢部分的关键基因进行分析。
图3 Ca. Acidulodesulfobacterales的代谢能力，关于碳、氮、硫和铁元素相关的代谢途径。
图4. 表达量最高的前二十个基因(左)以及相对表达量最高的前二十个基因(右)。红色方框代表共有的基因，星星代表与其他bins的存在显著性差异。
4.1 碳固定
如图3所示，在四个基因组中均鉴定到rTCA循环的存在，说明Ca. Acidulodesulfobacterales具有通过rTCA循环固定碳的能力。同时，宏转录组证实了rTCA循环中的基因存在表达，其中编码citryl-CoA合成酶的基因ccsAB在AP4中的转录活性相比与其他三个物种是最高的，证明Ca. Acidulodesulfobacterales可能是一种重要的自养微生物。
4.2 氮代谢
四个bins中均有nifDKH基因，该基因编码固氮酶，说明Ca.Acidulodesulfobacterales在生长过程中可以将无机氮转化成有机氮。根据转录组分析显示，AP4具有较高的固氮酶基因表达水平，但是在时间上没有显著性差异。固氮酶的相对转录活性随时间的延长呈现上升趋势。同时发现nifS和nifU基因的高表达(在固氮过程中必须的成熟酶)，其中AP4具有最高的表达量和相对表达丰度，表明Ca.Acidulodesulfobacterales在AMD生态的氮摄入中发挥着重要的功能，特别是AP4。进一步的，统计学分析显示nifDKH基因的相对转录丰度随着环境pH的降低和铁含量的升高而显著增加。
为了固定氮，Ca.Acidulodesulfobacterales还可以通过还原羟胺生成铵(在AP1,AP2,AP4中发现基因hcp)，其中AP2具有最高的hcp基因表达量。值得注意的是AP1具有尿素转移系统和脲酶基因，证明尿素可作为AP1的候选氮源。对于铵的转运和转化，编码铵离子转运蛋白、谷氨酰胺合成酶和谷氨酸合成酶的基因amt、glnA和gltD在四个物种中均存在，证明Ca.Acidulodesulfobacterales可以通过铵同化获得有机氮源用于生长。同时，AP3可以表达一氧化氮还原酶的相关基因(norB和norZ)，表明AP3拥有将一氧化碳转化为氮的潜力，综上所述，Ca. Acidulodesulfobacterales具有多种固氮策略。
4.3 硫代谢
高硫酸盐浓度是酸性矿山的重要特征。在AP1,AP3,AP4的基因组中发现了完整的硫酸盐降解途径。根据DsrAB蛋白序列的进化树分析显示来自Ca. Acidulodesulfobacterales(AP1,AP3,AP4)的dsrAB基因属于还原性(图5a)，表明Ca. Acidulodesulfobacterales是一种潜在的嗜酸SRB。同时dsrD基因的存在再次说明Ca. Acidulodesulfobacterales是一种嗜酸SRB而非硫酸盐氧化菌。但是令人意外是AP1, AP3, and AP4发现了与硫氧化相关的dsrL和dsrEFH基因，推断Ca. Acidulodesulfobacterales可以通过反硫酸盐还原途径将硫化物氧化成硫酸盐。根据AMD样本中的氧气含量(0.65-2.93 mg L-1)推断：浮游的Ca. Acidulodesulfobacterales或者生物膜表面生长的Ca. Acidulodesulfobacterales发生硫化物的氧化反应，生长在厌氧区的Ca. Acidulodesulfobacterales发生硫酸盐的还原反应。但是dsrD基因的相对转录活性要比dsrEFH基因的高很对，所以后者可能是主要的反应途径。另外，AP4的dsrAB基因的转录活性要比AP1和AP3高，因此，AP4在硫代谢中发挥着更加重要的功能。
同时AP4具有sqr基因的最高转录活性和相对转录丰度，说明Ca. Acidulodesulfobacterales具有产生硫化物的能力，特别是AP4，有利于解毒和元素的储存。同时在AP1, AP2和AP3的基因组中发现了soxA，soxB，oxY和soxZ基因的存在，说明Ca. Acidulodesulfobacterales具有氧化S2O32-生成S(0)的能力，其中AP3具有较高额soxB的转录活性。另外四个物种的基因中均存在编码丝氨酸-O-乙酰转移酶和半胱氨酸合成酶的基因cysE和cysM。表明Ca. Acidulodesulfobacterales具有利用合成的硫化物合成半胱氨酸和乙酸的能力。
图5. Ca. Acidulodesulfobacterales的dsr操纵子。a. DsrAB 蛋白的系统发育树。b. Ca. Acidulodesulfobacterales的dsr 操作子结构与其他已报道的dsr 操作子结构的比较。
4.4 铁代谢
结果显示在四个基因组中均存在cyt572-和cyl-like基因，AP1和AP4的基因组中存在cyt579-like基因，说明Ca. Acidulodesulfobacterales可能具有氧化铁并通过cyt572–cyt579–cyc1途径传递电子的能力，其中AP4具有较高的cyt572-like基因转录活性和相对转录丰度，同时在AP4的基因组中发现了编码亚铁氧化酶的基因iro-like，表明AP4可能是潜在的二价铁氧化菌。
除了上述的铁氧化基因，还在Ca. Acidulodesulfobacterales中发现了铁离子转运蛋白、储存蛋白以及相关的调控因子。对于二价铁的转运，四个物种基因组中存在两个拷贝的mntH基因，该基因的相对转录过程随着时间的延长而增长，但是RPKM没有发现显著的增长。其中AP4是mntH基因的主要转录微生物，表明AP4在铁代谢中发挥这重要的功能。另外，Ca. Acidulodesulfobacterales的基因组中发现了四种不同的依赖于TonB的膜外铁(III)转运体，这些不同类型的细胞受体使得Ca. Acidulodesulfobacterales可以使用多种不同的底物来维持自己的生长需要。因此，Ca. Acidulodesulfobacterales，尤其是AP4可能在铁代谢中发挥着重要的作用。
4.5 氧化磷酸化
在四个基因组中均发现了近乎完整的氧化磷酸化途径以及高亲和力的O2末端氧化酶(图4)。表明Ca. Acidulodesulfobacterales可能利用氧气作为总终电子受体。四个基因组中均存在编码细胞色素bd泛素氧化酶的基因(cydA和cydB)，这种酶在低氧条件下具有较高的氧气亲和力。AP1和AP3拥有两种基因的较高相对转录丰度相比的AP2和AP4，AP4拥有最高的转录活性(RPKM)。同时四个物种具有将近完整的NADH:醌氧化还原酶复体和F-type ATP酶基因簇，因此我们推断Ca. Acidulodesulfobacterales在原位系统中可以利用氧气。
4.6 发酵
本研究发现Ca. Acidulodesulfobacter可以通过发酵产生乳酸和乙醇，通过宏转录组分析显示，AP4具有最高的adhP酶的相对转录丰度和最低的LDH基因相对转录丰度，表明AP4可能进行乙醇发酵。AP1和AP2可能进行乙酸发酵通过Pta-Ack途径，因此，Ca. Acidulodesulfobacter可能是兼性厌氧微生物。
4.7 应激反应
酸性矿山是一种极端环境，低pH值，高金属浓度。当地的微生物必须适应这种极端环境才能生存。对于酸应激，Ca. Acidulodesulfobacterales表达编码钾离子转运ATP酶和钾离子摄取蛋白相关的基因kdpABC和kup基因，表明Ca. Acidulodesulfobacterales可通过吸收钾离子来应对酸胁迫。另外，Ca. Acidulodesulfobacterales可能通过代谢产生一些质子缓冲分子来维持细胞中中性例如磷酸盐和精氨酸。对于重金属的胁迫，Ca. Acidulodesulfobacterales基因组中发现多种重金属转运子基因发生转录，例如Cu(I)/Ag(I)流出系统，金属离子运输者，表明通过外排金属离子是Ca. Acidulodesulfobacterales应当金属胁迫的主要策略。对于氧气胁迫，Ca. Acidulodesulfobacterales可以表达过氧还蛋白和硫氧还蛋白还原酶相关基因。另外，赤鲜素蛋白和红素氧还蛋白的表达也有助于Ca. Acidulodesulfobacterales应对氧气应激。还包括细胞色素c551过氧化物酶和硫醇过氧化物酶的表达也有助于Ca. Acidulodesulfobacterales应对氧气应激。
评论
本研究关注的对象Ca. Acidulodesulfobacterales是一种极端环境中大量存在的微生物分类，例如酸性矿山等。18年前在16S rRNA扩增子测序结果中被发现。本研究提供了该目中的四个基因组，并发现该目的相对含量与铁含量显著性相关。通过基于基因组构建的代谢途径结合宏转录组技术揭示了该目的原位代谢特征。研究中发现该目在碳、氮、铁、硫元素的循环中发挥着重要的功能。同时揭示了该目微生物应对极端环境的机制。下一步，需要获得该更多该目的基因组，进一步揭示该目的生物地理学特征、比较基因组特征以及进化特征。这将拓展我们对该目物种多样性以及生态位功能的认识。
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