【情报汇编】湖泊水库中蓝藻及蓝藻毒素的监测技术和管理策略
小编导读
水源型湖泊与水库的管理对于全面保障城市水资源的安全具有战略性意义，其中尤以湖泊水库中藻毒素及其他新型有机污染物质的控制最为关键。本期栏目以蓝藻毒素的实时监控和管理为切入，以“第四届国际水协湖泊与水库管理研讨会”的相关最新研究成果为基础，汇总提炼相关信息，供读者参考。
在湖泊和水库的管理和维护工作中，蓝藻爆发问题一直都是不可回避的世界性困扰。原水中以微囊藻毒素（microcystin）、节球藻毒素（nodularin）、拟柱孢藻毒素（cylindrospermopsin）、蛤蚌毒素（saxitoxin）等为代表的多类藻毒素物质，以及土臭素（geosmin）和2-MIB等嗅味物质，都是蓝藻细胞的代谢产物，它们对人体的肠胃、肝脏等器官均会造成损伤，甚至具有一定的致癌性。近年来蓝藻水华出现的频率和强度呈现增长的趋势，由此带来的水生生物和人类中毒问题、饮用水处理中的毒素积累问题、饮用水的异嗅异味问题、暴露于蓝藻水环境的娱乐活动对人体健康的影响，以及使用存在藻毒素污染的地表水或再生水灌溉植被所造成的食物安全问题，都是关乎人类生存发展的严峻课题，亟待学术界和政府部门的共同攻关。因此各地水司必须采取一定的管理策略，建立和完善蓝藻爆发预测机制，确定蓝藻的预警浓度值，及时采取干预措施，有效地控制和避免藻类爆发事件的发生。其中快速准确地监测原水中蓝藻细胞的浓度，以及相应藻毒素和嗅味物质的浓度，迅速判断其是否超过预警值，是这些管理措施得以顺利落实的先决和关键所在。基于此，“第四届国际水协湖泊与水库管理研讨会”开设了“蓝藻毒素监测和管理”专题，来自全球各地的专家学者就蓝藻监测和管理领域的科研成果、管理经验、政策导向以及技术瓶颈等展开了广泛的探讨和交流。本期情报汇编对此进行了提炼和梳理，望能给相关从业人员以新的启发和思考。
蓝藻在线监测技术
1.1
qPCR技术和ELISA技术
近年来，实时荧光定量聚合酶链式反应技术（qPCR，real-time quantitative PCR）和酶联免疫吸附测定技术（ELISA，enzyme-linked immunosorbent assay）在蓝藻及其相关代谢产物在线检测中的应用逐步广泛。ELISA技术是把抗原抗体的免疫反应和酶的高效催化作用原理有机结合起来的一种检测技术，既保持了酶催化反应的敏感性，又具有抗原抗体反应的特异性，可简单有效地检测水样中微囊藻毒素、拟柱孢藻毒素等毒素的存在情况。qPCR技术是利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化[8]，可快速地检测水库原水中与毒素、嗅味物质等蓝藻代谢产物的产生相关的基因。
Lin团队利用qPCR、ELISA、显微镜观察以及GC/MS等检测手段（如图1所示），考察了微囊藻毒素、拟柱孢藻毒素、蛤蚌毒素等蓝藻毒素和2-MIB等蓝藻代谢产物，与相关基因之间的相互关系。结果表明，对于微囊藻毒素、拟柱孢藻毒素和蛤蚌藻毒素来说，其母体蓝藻数量、毒素浓度以及和毒素表达相关的基因复本数量之间的线性关系显著。利用此方法调查台湾和菲律宾水库中蓝藻和蓝藻代谢污染物的存在情况，发现微囊藻、拟柱孢藻及其各类代谢产物的存在情况较为显著，而部分地区微囊藻毒素、拟柱孢藻毒素的浓度超过了世界卫生组织（WHO）建议的饮用水指导浓度（1.0 μg/L）。
图1 蓝藻、藻毒素和嗅味物质的检测方法
此外，由于藻类代谢产物的浓度和相应基因的丰度之间存在良好的线性关系，加之基因方法更加省时，且对代谢产物具有高度的专一性，因此Lin等提出了可设置三个级别的微囊藻和拟柱孢藻的基因丰度警戒水平（如表1所示），作为WHO和澳大利亚水质中心原先建议的微囊藻毒素和拟柱孢藻毒素的三个级别警戒浓度（0.3、1和10 μg/L）的补充，以更好地建立针对水库蓝藻爆发和蓝藻毒素超标的预警系统。
表1 根据藻类代谢物质产生基因建立的预警水平
1.2
荧光探针技术及环境因素的影响
常规的蓝藻浓度测量方法有无需化学提取的显微镜计数法，以及需要提取藻类特征物质（如色素等）的定量聚合酶链反应法（qPCR），然而它们都依赖于技术人员的熟练操作，且分析结果存在滞后性，无法在短时间内得到准确稳定的分析结果。与此同时，近年来逐渐发展的荧光探针技术（fluorometric probes）可实现原位在线估测藻类细胞的浓度，为快速及时地预测蓝藻爆发，提供了理论依据和技术途径。
然而在实际的复杂水环境中，荧光探针的检测往往存在各种干扰，干扰来源主要有：1）蓝藻细胞自身的特性。藻青蛋白在不同蓝藻细胞内的含量和聚集形态不同；光曝前后的蓝藻细胞可能存在差异；其他物种所含的叶绿素a以及藻胆色素（藻青蛋白和藻红蛋白）会影响荧光的检测；在自然环境中，胞内和胞外色素之间存在色差。2）水质状况，如浊度、水温以及水中颗粒物造成的光散射等。3）荧光探针设备本身在测量荧光的同时，也需要估测细胞数、生物量等参数对原始数据进行校正，此处也会存在一定偏差。
针对此，Zamyadi等基于显微镜计数法、生物量估算、藻青蛋白提取以及嗅味物质分析等手段，考察了诸如浊度、生物量、其他藻产生的荧光以及设备自身的校正等因素对目前市售的6种荧光探针设备的影响。
研究表明，当悬液中只存在单一蓝藻时，显微镜计数与6种荧光探针的试验结果相关性均较好，表明荧光探针技术的稳定性较佳；同时，当蓝藻浓度较低时，探针检测结果的重现性良好。然而在实际应用中，水体中往往含有多种藻类，且水质情况更为复杂，在这种条件下，荧光探针检测蓝藻的试验结果存在一定偏差。当水体中的绿藻浓度和浊度增大时，荧光探针测得结果的偏差也变大；与此同时，通过平行测定水体中叶绿素a的含量，在一定程度上可以有效地修正荧光探针所测得的藻青蛋白剩余信号，使检测结果更加准确。对比各荧光探针设备的试验结果，选择综合效果最佳的一款设备应用于实际的蓝藻实时检测中，结果显示该荧光探针设备能够很好地检出澳大利亚某水厂的进厂水中较高含量的蓝藻。图2为实际水厂中的实时荧光探针检测设备。在此基础上在水源地或水厂内施以适当的前处理工艺（如投加高锰酸钾等）进行调整，就能有效去除水中的蓝藻。
图2 澳大利亚某水厂中的荧光探针检测设备
未来在该领域的研究热点包括通过基因组学（genomics）手段得到水中生物的更多信息，以及结合高密度的原位荧光检测和详尽的基因组学信息建立蓝藻的预测模型等。
1.3
激发-发射光谱法
Lee等介绍了一种荧光技术——激发-发射光谱法（EES，Excitation-Emission Spectroscopy）在蓝藻实时监测中的原理和应用，并对EES法和qPCR技术各自的优势进行了总结和比较。
藻类的色素分子（叶绿素a等）吸收光线后，所吸收的一部分能量会重新以荧光的形式激发出来。由于同一纲目的藻类所含的色素性质和数量相似，其发射的荧光具有相似的能量，因此在特定的发射波长（680 nm）下产生的荧光光谱是独一无二的；与此同时，同一纲目藻类受到不同波长的光照射时，发出的荧光强度也不同。因此可根据不同波长的激发光来区别不同纲目的藻类（绿藻、蓝藻、褐藻、红藻等）。叶绿素a作为一种光合色素广泛存在于所有的藻类细胞中，因此通常可通过叶绿色a的荧光信号来检测藻类的存在水平；但蓝藻细胞产生的叶绿素a荧光信号相对较弱，因其荧光发生系统主要位于光合系统II，故藻胆素（藻青蛋白）产生的荧光强度更高，所含的光谱信息更加丰富，更适合用来估测蓝藻细胞的丰度。
基于EES，Lee等介绍了某公司研发的在线藻类监测传感器，可通过7种不同波长（365、450、525、570、590、615和710 nm）的激发光来监测水中不同藻类的存在情况。如图3所示，仪器在工作时，7种不同波长的激发光以很高的频率逐次对水样进行照射，通过测算不同波长的激发光对不同藻的“激发值”，即可得到不同藻类的浓度。同时，仪器会检测水样的溶解性有机物（DOM）和浊度值，对得到的藻类浓度进行修正，以提高结果的准确性。
图3 基于EES技术的在线藻类监测传感器的工作原理图
EES技术和qPCR技术的比较如表2所示。
表2 EES技术和qPCR技术的比较
EES技术的优势有：1）稳定高效，可在目标水域环境中快速安置实时监测系统；2）可连续提供与蓝藻爆发相关的关键数据；3）可根据实际场景选择便携式或固定式设备；4）可依托该技术建立水华预警系统。EES技术未来的发展趋势有：1）采用在线流式细胞仪（online flow cytometry）来计量蓝藻细胞的数量；2）在系统平台上将EES技术和水体净化技术相结合（如投加H2O2或采用超声处理技术）。
qPCR技术的优势有：1）可用于分析毒性蓝藻的丰度在时间和空间上的分布情况，建立其在水体环境中的种群动力学模型；2）可同时分析多个蓝藻基因，适用于复杂水华的评估；3）灵敏度高（<100 基因复本/mL），适合考察低丰度下的产毒蓝藻。qPCR技术未来的科研热点有：1）研究qPCR原型（prototype）来建立“芯片实验室”（lab-on-chip）以实现实时监测；2）加快分子生物学技术方面的研究。
将两者相结合以实现对毒性蓝藻的实时监测，也是今后重要的研究方向之一。
1.4
平面波导阵列生物传感检测器
鉴于传统的HPLC、GC/MS等方法检测微囊藻毒素比较费时费力，且需要消耗大量化学试剂，Zhou等介绍了一种基于倏逝波场（evanescent wave field）、能快速和同时定量多个样品中的微囊藻毒素的平面波导阵列生物传感检测器（planar waveguide array biosensor）。
该装置的示意图如图4所示。仪器的主要构成元件包括：一端面为一定角度斜切面的平面波导基片（planar waveguide chip），用来向波导基片斜切端面边缘发射激光的线发生器（line generator），用来引入样品至波导基片表面的可拆卸的聚二甲基硅氧烷流动室（PDMS flow cell），由16根塑料光导纤维组成的信号收集系统，以及数据处理系统。
图4 平面波导阵列生物传感检测器的工作原理图
样品采用间接竞争免疫法（indirect competitive immunoassay）进行分析测定。先将做过标记的抗体以一定的浓度和待测样品充分混合一定时间，使待测物完全占据抗体的结合位点，这一过程称为“预孵化”（pre-incubation）。随后样品被送入流动室的独立线性通道，样品内未同待测物结合、还存在自由结合位点的抗体，与基片上的半抗原共轭物（hapten conjugate）结合，形成生物传感面，这一过程称为“孵化”（incubation）。“孵化”反应后，固定下来的抗体量，与样品中待测物质的浓度呈反比，且与被倏逝波场（由全反射光线产生）激发所形成的荧光信号的强度之间，存在对应关系，可被量化。产生的荧光信号被基片下方的平行多模式纤维收集，由数据处理系统进行处理，对背景信号噪声进行分析和修正，得到最终定量结果。
在最优试验条件下，该检测方法的检出限可达到0.67 μg/L，达到了饮用水国家标准（GB 5749-2005）中微囊藻毒素的检测水平。该方法检测灵敏度高，且可以同时定量多个样品中的微囊藻毒素，具有很好的应用前景。
2
蓝藻监测管理策略
2.1
新加坡水库藻毒素监测和管理的策略和方法
作为一个陆地面积只有719 km2而人口密度高达7 600人/km2的岛国，水资源紧缺问题一直都是新加坡国家发展和民众生存必须面对的挑战。为此，新加坡的国家水务机构PUB一直都致力于通过先进高效的管理和技术手段来提供可持续的供水服务。目前新加坡境内共有17座饮用水水库，确保水源地的水质安全，是确保生活、生产、娱乐活动等用水安全的重要前提，也是PUB水质管理一体化方案中的关键环节。作为一个热带国家，新加坡水库拥有种群数量较多的蓝藻，必须时刻警惕蓝藻爆发的潜在风险，为此PUB很早便将相关的防护举措纳入了其水安全计划框架。来自PUB的专家Mong Hoo Lim在会上介绍了新加坡在蓝藻和其代谢产物的监测、风险评估以及控制管理方面所拥有的成熟技术和经验。
2.1.1
源头控制
对N、P等营养物质的源头控制，是全球各地公认的控制藻类生长的关键策略。在这方面，PUB将重心放在使潜在污染源的营养物负荷最小化上，事无巨细，例如，及时对下水管道进行修复以减少污水渗漏，防止餐饮业密集区域的污水和垃圾进入城市水道，防止施工地区的土壤因暴露而流失，提升车间的清洁技术以及使用环境友好的水路交通工具来减少油类污染物的排放等等。与此同时，借助曝气，以及通过各水库之间的水力调度使水流循环强化（如滨海水库循环计划，Marina Reservoir Recirculation Scheme）等手段，达到控制藻类生长的目的。此外，公众参与也是PUB管理计划中的重点和亮点，根据一项名为“Active, Beautiful, Clean Water”的计划，经污染防治措施整改过的河道和水库，会通过适当的娱乐活动形式吸引市民前来参观游玩，既引导公众参与监管，同时也教育公众时刻珍惜新加坡宝贵的水资源。
2.1.2
水质监测
从饮用水源头到居民自来水龙头，PUB有一套综合的水质监测方案。在湖库蓝藻管理方面，除采用在线垂直水质分析和实验室分析对营养物质等在内的常规水质参数进行监测外，叶绿素a浓度、藻细胞计数、藻毒素浓度等也是PUB密切关注的参数。新加坡水库共设有22套在线水质分析设备，并配备“绞车系统”（winching system），每隔15分钟就会对不同水深的水样进行分析；采用显微镜计数法对原水中的藻类进行每月例检，并针对水库潜在的藻华迹象进行例行巡检，发现藻华后，一般启动如下过程：收集浮藻和水样并清理浮藻——检测藻类是否为产毒藻——对水样进行藻毒素分析——进一步实施干预；最新的监测数据显示，新加坡水库原水中检出频率最高的藻毒素依次为拟柱孢藻毒素、微囊藻毒素-RR和微囊藻毒素-LR，最大浓度达到1~5 μg/L。由于检出的藻毒素浓度普遍较低，无短期治理的必要，因此PUB将工作重点放在藻类和藻毒素的中长期削减上，如营养物污染源控制等。
2.1.3
标准制定
根据新加坡环境局颁布的《环境公共健康规程》（Environmental Public Health Regulations），管道饮用水中自由态和细胞结合态微囊藻毒素-LR的总含量须低于1 μg/L，这一标准的考量和大部分国家和地区一样，是建立在WHO提出的参考浓度的基础上的；为达到这一标准，微囊藻细胞的浓度须控制在10 000 cells/mL以下。PUB的水质观测数据表明，当TN:TP大于18，而TP小于0.035 mg/L时，微囊藻的浓度便可控制在10 000 cells/mL以下。同样基于WHO在2003年发布的标准，新加坡规定，在和人体有直接接触的娱乐用水的水体环境中，叶绿素a的浓度必须低于50 μg/L；高于此浓度时，水中很有可能会存在藻类毒素，威胁人体健康和生态安全。
2.1.4
科研技术
为提高藻类控制和水质监测的效率，更好地应对蓝藻爆发危机，PUB也投入了大量精力在相关的科研攻关和技术开发上。PUB主导或参与的科研项目有：
（1）采用PCR技术建立方法来监测产毒蓝藻，并应用该方法考察新加坡10座水库中5种毒性蓝藻的存在水平，以及确认其中优势蓝藻的种类。结果表明铜绿微囊藻（M. aeruginosa）和拟柱孢藻（C. raciborskii）分别是新加坡水库中微囊藻毒素和拟柱孢藻毒素最主要的产生蓝藻。根据该研究结果，PUB自2009年起将拟柱孢藻毒素也纳入常规监测的范围。
（2）研究产毒蓝藻在新加坡水库中的空间和时间分布、它们的产毒素率速率以及对环境因子变化的反应。结果表明，新加坡水库中超过70%的微囊藻可以产生微囊藻毒素（MC-LR和MC-RR），或含有相应的产毒基因；有两种拟柱孢藻株可以产生拟柱孢藻毒素。营养物质（N、P等）对藻类的生长影响重大；气候变暖可能不会影响藻类的生长，但会影响藻类的产毒素率；光照的影响较小。
（3）研发或引进先进的技术设备，并进行实证和投入应用，包括各种在线自动监测设备、新型智能水评估网络（New Smart Water Assessment Network）、水下无人驾驶车（Autonomous Underwater Vehicle）、超光谱成像技术（Hyper Spectral Imaging）、手持式光谱仪（Water Inside Spectrometer）等。
（4）研究超声技术控藻。超声系统发出特定频率和能量的超声波，在水库表层形成超声压力，迫使藻类下沉，防治其上升至水层表面进行光和作用；同时超声波也能在保持藻细胞壁完好的情况下，破坏其细胞内部结构，甚至能产生自由基来氧化藻细胞。超声装置如图5所示。
图5 超声控藻系统
2.2
建议更新加拿大微囊藻毒素指导标准
Lo等对LC-MS/MS方法和ELISA方法对于微囊藻毒素的检测进行了比较，并根据研究建议，加拿大现有的饮用水微囊藻毒素浓度标准需有所改进。
基于以往的技术限制，饮用水中微囊藻毒素的官方检测方法（安大略环境署，MOE）为LC-MS/MS；而在微囊藻毒素的90多种变体（variants）中，检测的项目只有“微囊藻毒素-LR”，浓度限值为1.5 μg/L。事实上随着技术的发展，更加便捷高效的ELISA技术已逐步被MOE采用，用于饮用水和地表水中微囊藻毒素的检测。由于ELISA技术只能检测会和抗体发生免疫交叉反应的所有抗原（微囊藻毒素），不能定量检测某单一抗原（微囊藻毒素-LR），因此现有的《安大略饮用水水质标准规范》（Ontario Drinking-Water Quality Standards Regulation，O. Reg. 169/03）需要有所调整，从只检测微囊藻毒素-LR的浓度到检测微囊藻毒素所有90多种变体的总浓度，以减轻当前对于LC-MS/MS方法的政策依赖。
在一项长达3年的研究中，Lo等采集了849个水样（包括地表水、原水和处理后饮用水），对其中的微囊藻毒素分别用ELISA方法和LC-MS/MS方法进行平行测定，比较两种方法的结果，总结如表3所示。Tukey-lambda概率曲线的相关系数显示，ELISA和LC-MS/MS的数据样本总集符合柯西分布，两者之间并不显著相关（p<0.0001，Wilcoxon符号秩检验），表明两种方法检测结果的准确性存在一定偏差。根据Bland-Altman分析，ELISA方法的检测结果普遍要比LC-MS/MS的高，说明ELISA方法能够检测更多的微囊藻毒素变体。而采用蛋白磷酸酶抑制检测（Protein Phosphatase Inhibition Assay）发现，ELISA检出而LC-MS/MS未检出的样品，同样存在毒性，毒性强度和微囊藻毒素浓度呈现相关性。在不同实验室（省级、市级以及私营实验室）、采用不同厂商生产的设备，对ELISA检测方法的准确性和重现性进行考察，发现无论是微囊藻毒素单一样品还是和其他藻毒素（类毒素-a、拟柱孢藻毒素）的混合样品，ELISA方法的准确性和重现性均较为理想。
表3 ELISA和LC-MS/MS的比较
根据用户友好、灵敏度、可靠性、检测周期、成本、使用门槛等因素综合考量，采用ELISA作为检测微囊藻毒素的首选方法，LC-MS/MS作为补充方法，是较为科学准确的检测手段。因此Lo等建议改用ELISA作为加拿大饮用水标准中微囊藻毒素的检测方法，而标准中的“微囊藻毒素-LR浓度”也应改为“微囊藻毒素浓度”，以更加科学全面地反映水中微囊藻毒素的存在水平。
3
结语
湖泊水库中蓝藻和蓝藻毒素的有效监测和管理，对于防止大规模的蓝藻爆发，以及下游水厂及时调整工艺以提高饮用水中蓝藻毒素的去除效果，具有重要意义。随着检测手段的发展与进步，更加高效便捷的ELISA、荧光检测、qPCR等技术在蓝藻的实时监测中得到了越来越广泛的应用。而新技术的进一步推广和使用，还需要对实际应用场景中可能会面临的问题进行进一步的研究和论证，如方法的可靠性、在不同水体环境中的适用性、各种环境因素的干扰、技术成本等。与此同时，相关的管理手段也应不断更新和完善，在现有的框架体系中及时引入和发展新的技术手段和管理内容，建立和健全高效的蓝藻预警机制、蓝藻和蓝藻毒素的水质检测标准等。
推荐参考
曹徐齐,阮辰旼.湖泊水库中蓝藻及蓝藻毒素的监测技术和管理策略——“第四届国际水协湖泊与水库管理研讨会”成果汇编一[J].净水技术,2017,36(8):5-12.
Cao X, Ruan C. Monitoring technologies and management strategies of cyanobacteria and cyanotoxins in lakes and reservoirs: Compilation of research findings of 4th IWA Symposium on Lakes and Reservoir, Part I [J]. Water Purification Technology, 2017, 36(8):5-12