结核病临床检验手段解析
结核病
临床检验手段解析
主讲-韩成钰
诊断结核病的临床检验手段，根据其基本原理，可以分为三类
1、基于分枝杆菌特异性免疫记忆的检验，例如结核菌素试验、γ-干扰素释放试验和分枝杆菌抗体检测。
2、基于组织病理学的检验，例如抗酸染色法寻找标本中的分枝杆菌，和通过特异性的组织病理学表现（例如干酪样肉芽肿）来诊断活检标本中的活动性结核感染。
3、基于分子生物学的检验，例如商业化的核酸扩增-探针法平台（如赛沛公司的Xpert MTB/RIF技术、生物梅里埃公司的GenoType MTBDR技术），以及由专业医学检验室进行的核酸扩增-下一代测序检验。
A
基于分枝杆菌特异性免疫记忆的检验
国家药品监督管理局批准了结核菌素皮肤试验（TST，有的地区称为PPD）和两种γ-干扰素释放试验（IGRAs）试剂盒用于检测人体对结核分枝杆菌（MTB）的特异性T细胞免疫反应。
此类检验的基本原理：
人体感染结核分枝杆菌后，无论是处于潜伏感染状态还是已进展为活动性结核，只要人体的免疫系统正常，则T细胞都会长期存在免疫记忆（也就是俗称的“一朝被蛇咬，十年怕井绳”）。
（具体表现为当T细胞接触了结核分枝杆菌的特异性抗原，或接收到了免疫系统分泌的白介素-12（一种帮助传递分枝杆菌免疫信号的分子）时，便会释放γ-干扰素，从而激活针对结核分枝杆菌的特异性免疫反应。）
TST和IGRAs通过测试免疫系统是否存在对结核分枝杆菌的特异性免疫记忆，来判定患者是否感染结核分枝杆菌。
TST或IGRAs结果呈阳性，通常提示患者存在结核分枝杆菌感染，但不能确定结核分枝杆菌感染的活动性（既可能是潜伏性结核感染，也可能是活动性结核病），亦不能作为诊断结核病的依据。
关于TST：
该检查通过对患者进行结核菌素皮内注射，并在48-72小时候判读注射部位反应，从而检验MTB的免疫记忆是否存在。TST的检测效能会受到很多因素的干扰，包括：
1、曾接种过卡介苗（BCG）；
2、当前或既往感染了非结核分枝杆菌（NTM）；
3、当前或既往生活于结核病高发区（例如东欧或东亚地区）；
4、处于免疫妥协状态（例如患慢性病或长期服用免疫抑制剂）；
5、患有某些原发性免疫缺陷病，或艾滋病。
当存在这些因素时，应考虑使用替代手段（例如IGRAs）。
关于IGRAs：
IGRAs检查会先获得患者的少量静脉血，然后将离心获取的患者的单个核细胞于富含结核分枝杆菌抗原的环境中孵育，最后检测被激发出特异性免疫记忆的T细胞数量，并结合同时孵育的阳性对照孔和阴性对照孔，判定患者是否存在结核分枝杆菌感染。
（在我国，最常使用的IGRAs试剂盒为牛津免疫公司的T-SPOT.TB，该技术会在建立对照孔的同时，分别将单个核细胞放置于含有ESAT-6抗原和CFP-10抗原的培养皿中进行孵育。由于培养皿中存在特殊的显色物质，因此当T细胞被激发出特异性免疫记忆，并释放出γ-干扰素的同时，此T细胞就会在培养皿中显示成一个深色斑点。在判读结果时，仅需将对照孔和试验培养皿中的斑点密度进行计数，即可得出结果。）
IGRAs对结核分枝杆菌感染的特异性强，不会受到BCG、NTM等因素的影响，因此被美国疾控中心（CDC）推荐优先用于接种过BCG，或长期居于结核病高发区的人群。但值得注意的是，处于免疫妥协或免疫缺陷状态的人群，以及存在对分枝杆菌的孟德尔易感性（例如先天缺乏白介素-12，或T细胞分泌γ-干扰素的能力受损）的患者，其IGRAs结果呈现假阴性的概率和TST相仿；而IGRAs用于结核低流行区（例如北美和西欧）人群时，可能出现假阳性结果。此外，IGRAs价格昂贵（通常在500-1200元之间），用于单纯筛查潜伏性结核感染时，可能不如TST划算。
分枝杆菌抗体检测技术不成熟，且敏感性和特异性均差，不推荐用于诊断结核分枝杆菌感染。
B
基于组织病理学的检验
强烈提示活动性结核病的指证，也是活动性结核的确诊依据之一。现代抗酸染色技术足够精准，但因结核分枝杆菌和部分NTM的细胞壁结构有相似性，所以抗酸染色不能区分结核病和NTM感染。如果患者临床感染结核分枝杆菌的概率不高，例如IGRAs或分子学检查阴性，则要考虑NTM感染的可能。另外，抗酸染色阳性和多重耐药结核病（MDR-TB）有关，抗酸染色阳性的结核病患者应考虑加做快速利福平耐药试验（例如Xpert MTB/RIF）。
对疑似受累的组织进行病理检验时，即使抗酸染色阴性，亦能发现一些提示结核感染的线索。当病灶在镜下表现为干酪性肉芽肿，尤其是伴有上皮样巨噬细胞、朗格汉斯巨细胞和淋巴细胞浸润时，可支持结核病诊断。但应注意，病理检验的有效性高度依赖取样技术和检验技术，活组织/分泌物样本的采集、保存、检验过程的失误会导致最终结果不可靠。
C
基于分子生物学的检验
分子学检验的原理是利用聚合酶链反应（PCR）在体外扩增结核分枝杆菌核酸序列，再使用探针或下一代测序（NGS）等技术检测结核分枝杆菌核酸序列在标本中的数量，从而推算出拟检标本是否感染结核分枝杆菌，以及（如果感染时）结核分枝杆菌的相对丰度、耐药情况等。不同的分子生物学检查所针对的结核分枝杆菌核酸部位不同，较常见的靶点包括结核分枝杆菌16S核糖体RNA（rRNA）、DNA rpoB基因等。
目前为止，临床应用经验最多的结核病分子学检验手段为Xpert MTB/RIF，其也是美国感染性疾病学会（IDSA）、CDC和WHO等权威学术组织所一致推荐的结核病分子学检验手段。该技术通过巢式实时PCR（RT-PCR）来扩增并检测结核分枝杆菌的rpoB基因，由于rpoB基因在不同微生物中差异巨大，且结核分枝杆菌的rpoB基因存在决定其对利福平的耐药性的利福平耐药决定区（RRDR），因此Xpert MTB/RIF可在高效诊断结核病的同时，快速提供检出的（若有）结核分枝杆菌的耐药信息。不仅如此，Xpert MTB/RIF还采用了高度集成化的试剂盒和便携性良好的检验平台（GeneXpert），所以该检验可由经过简单培训的非检验科医生（甚至是全科医生和乡村医生）进行，也可以满足资源有限地区“流动检验”的需求。
Xpert MTB/RIF在检测绝大多数类型的标本时都可以维持极佳的特异性，并且即使在抗酸染色无法提供信息的情况下，仍可以准确鉴别出绝大多数感染了结核分枝杆菌的标本。然而应注意，单次Xpert MTB/RIF阴性（尤其是检测抗酸染色阴性的痰标本，或检测脑脊液等非痰标本时）不能排除结核病，该技术在检测近期痊愈的肺结核病人的标本时存在假阳性可能，且其对监测治疗效果没有价值。
除了Xpert MTB/RIF，多种商业化分子检验平台也被用于检验结核病，尤其是用于检验痰涂片和/或Xpert MTB/RIF阴性的疑似结核病标本。然而截止目前，仅有GenoType MTBDR被WHO推荐用于诊断结核病。和Xpert MTB/RIF不同，GenoType MTBDR通过对结核分枝杆菌的多个耐药决定基因（包括rpoB、katG、inhA、gyrA和rrs）进行线性杂交分析，从而在提高了对抗酸染色阴性标本的敏感性的同时，亦可以提供结核分枝杆菌对利福平、异烟肼、呼吸喹诺酮和氨基糖苷等多种一线/二线抗痨药物的药敏信息。不过由于GenoType MTBDR并非设计用于快速结核病诊断，该检测通常需要24-48小时才可给出结果，且需要专业分子诊断人员进行操作。
作为一项前沿技术，PCR-NGS检测近年来被不少医疗机构用于感染性疾病的初步诊断，其中大部分检测由临床医生委托商业医学实验室进行。在PCR-NGS检测流程中，专业分子诊断人员会利用测序仪对扩增出的核酸序列进行实时测序，并将序列信息利用生物信息学手段与现有已知的微生物核酸序列进行比对，从而判读出样本中存在的全部可疑微生物序列及其相对丰度。相比于其他分子学检验手段，PCR-NGS可以为临床医生提供标本中全部可疑微生物的相关信息，且其检测致病微生物的敏感性较高。但当前广泛实施的、由商业医学实验室进行的“宏基因组”微生物检测，普遍存在特异性差、对特殊病原体（如分枝杆菌）的敏感度不确定、检测报告存在误导性、价格昂贵等问题；而医院临床检验科室所进行的、针对特定病原微生物的PCR-NGS检测和种属区分，则存在质控不稳定、敏感度低等问题，另外由于大部分医院难以招聘到可熟练进行PCR-NGS等分子诊断的微生物学专业人员，此类检查预计在很长一段时间内都难以推广。
在我国，Xpert MTB/RIF和GenoType MTBDRplus被国家药品监督管理局批准用于疑似肺结核病患者的痰标本分子诊断和结核分枝杆菌耐药检测，而GenoType MDRTBsl则在部分结核病专科诊疗机构中用于罕见病例的诊疗及临床研究，但尚未获得正式批准。另应注意，PCR-NGS检测的结果不能作为感染性疾病（包括结核病）的确诊依据，使用未经其他检验手段（如微生物培养、获批准的商业化检验平台）确认的PCR-NGS检测结果用于指导临床治疗存在法律风险。
附：文中的缩写名词表
MTB（Mycobacterium tuberculosis，结核分枝杆菌）
TST（Tuberculin Skin Test，结核菌素皮肤试验）
PPD（Purified Protein Derivative Test，结核分枝杆菌纯化蛋白衍生物试验）
IGRAs（Interferon Gamma Release Assay，γ-干扰素释放试验）
BCG（Bacillus Calmette-Guérin Vaccine，卡介苗）
NTM（Nontuberculous Mycobacteria，非结核分枝杆菌）
CDC（Centers for Disease Control and Prevention，美国疾控中心）
WHO（World Health Organization，世界卫生组织）
IDSA（Infectious Diseases Society of America，美国感染性疾病学会）
MDR-TB（Multi-Drug-Resistant Tuberculosis，多重耐药结核病）
PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链反应）
NGS（Next-Generation Sequencing，下一代测序）
RT-PCR（Real-Time Polymerase Chain Reaction，实时聚合酶链反应）
END
作者：韩成钰
排版：冯连彩