酵母系统蛋白表达纯化实验服务周期
毕赤酵母表达系统介绍
毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统是近年来发展迅速、应用广泛的一种真核表达系统。它是甲醇营养型酵母菌，有两个乙醇氧化酶（Alcohol oxidase, AOX）编码基因AOX1和AOX2，两种序列相似，AOX1基因严格受甲醇诱导和调控。当甲醇为唯一碳源时，AOX1启动子可被甲醇诱导，启动乙醇氧化酶的表达，从而用甲醇进行代谢，含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的基因的表达。
表达菌株特点
GS115：AOX1和AOX2基因都正常表达AOX蛋白（乙醇氧化酶），甲醇的利用率高，接近于野生型，属于甲醇快速利用型（Mut+）
KM71：AOX1基因被大部分剔除，只能利用AOX2为AOX编码，甲醇的利用速率变慢，表现为甲醇慢利用型（Muts）
外源基因的整合方式不同会导致表达菌株的表型不同：
菌株表型
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限制酶 |
插入位点 |
GS115表型 |
KM71表型 |
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Sa1I/Stul |
HIS4 |
HIS+Mut+ |
HIS+MutS |
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Sacl |
5’AOX1 |
HIS+Mut+ |
HIS+MutS |
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Bg1II |
取代AOX1 |
HIS+MutS |
HIS+MutS |
常用表达载体及筛选标记
载体信息
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表达类型 |
载体名称 |
筛选标记 |
启动子 |
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胞内表达 |
pAO815 |
HIS4 |
AOX1 |
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pPIC3K |
HIS4 |
AOX1 |
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pPUC3.5K |
HIS4 |
AOX1 |
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分泌表达 |
pPICZα,A,B,C |
Bler |
AOX1 |
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pPIC9K |
HIS4 |
AOX1 |
信号肽
对于胞外表达的蛋白除了可以用载体自带的信号肽，还有以下信号肽可供选择：
信号肽序列
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信号肽 |
蛋白序列 |
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αMF* |
MRFPS IFTAV LFAAS SALAA PVNTT TEDET AQIPA EAVIG YSDLE GDFDV AVLPF SNSTN NGLLF INTTI ASIAA KEEGV SLEKR EAEA |
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Dse4 |
MSFSS NVPQL FLLLV LLTNI VSG |
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Exg1 |
MNLYL ITLLF ASLCS A |
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Scw11 |
MLSTI LNIFI LLLFI QASLQ |
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Salb |
MKWVT FISLL FLFSS AYS |
毕赤酵母表达系统的优势
1. 含有特有的强有力的AOX（醇氧化酶基因）启动子，用甲醇可严格地调控外源基因的表达。
2. 培养成本低，产物易分离，毕赤酵母所用发酵培养基成本合理，一般碳源为甘油或葡萄糖及甲醇，其余为无机盐，培养基中不含蛋白，有利于下游产品分离纯化。
3. 外源蛋白基因遗传稳定，外源基因能以高拷贝数整合到毕赤酵母基因组中，不易丢失并能得到高表达菌株。
4. 作为真核表达系统，毕赤酵母具有真核生物的亚细胞结构，具有糖基化、脂肪酰化、蛋白磷酸化等翻译后修饰加工功能。
酵母表达系统的优势
1. 具备完备的毕赤酵母表达平台，可以根据蛋白特性或客户的需求设计不同的实验方案；
2. 具有高通量的筛选平台，可以快速有效的得到最佳表达条件；
3. 具有大规模发酵生产能力
服务组合
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服务项目(Service Items) |
周期（周）Time(weeks) |
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蛋白分析与密码子优化 |
项目开始前完成 |
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基因合成 |
2~4 |
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亚克隆 |
1 |
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基因表达纯化测试 |
2 |
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发酵与纯化 |
1~2 |
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总计 |
6~9 |