文献解读 | Btbd 18通过转录延伸调节pRNA生成位点的一个子集
论文：BTBD18 Regulates a Subset of piRNA-Generating Loci through Transcription Elongation in Mice（Btbd 18通过转录延伸调节pRNA生成位点的一个子集）
摘要
Piwi相互作用RNA(PiRNAs)是动物生殖细胞发育所必需的非编码小RNA。尽管对转录后处理过程进行了大量的研究，但用于哺乳动物pRNA生物发生的染色质调节因子仍有很大一部分未被探索。
在此，我们发现BTBD 18是小鼠睾丸中的一种粗线核蛋白，占据了粗线pRNA产生位点的一个子集。烧蚀Btbd 18在小鼠中破坏了pRNA的生物合成，阻止精子发生，并导致雄性不育。
转录组分析、染色质可及性和RNA聚合酶II的占据情况表明，BTBD 18通过促进转录伸长促进粗线型piRNA前体的表达。因此，我们的研究发现BTBD 18是通过RNA聚合酶II延伸到基因组pRNA位点上激活转录的特异性调控因子。
凋亡细胞在减数分裂后期出现，而生殖细胞的发育在圆形精子细胞期被阻断
Btbd 18基因编码一种进化保守的蛋白质。我们最初关注的是btbd 18，认为它是一种在早期胚胎发生中很有希望的重编程因子，因为在全能的2-细胞胚胎中转录本的丰度很高。
另见Unigene中的表达谱和蛋白质的核定位。为了阐明其在发育过程中的作用，我们通过基因靶向基因第5外显子，产生了基因敲除小鼠。Btbd 18若要删除大部分编码序列，请执行以下操作。
杂合子(+/−)Btbd 18零小鼠产生具有预期孟德尔比率的幼犬。正常出现纯合子(−/−)缺失小鼠是通过将纯合空雌小鼠与杂合子雄性空鼠交配而产生的，表明在BTBD 18缺失的情况下，正常胚胎发生是正常的。
令人意外的是，当纯合空雄性与杂合或纯合子的雌性小鼠共笼时，没有产生幼仔，证明Btbd 18突变雄性不育。因此，我们从对照组(杂合子)和Btbd 18零(纯合子)雄性，并发现突变睾丸明显小于对照组，提示精子发生异常。
在精子发生过程中，精原细胞分化为精母细胞，分化为单倍体圆形精子细胞，启动精子发生，形成成熟精子。组织学检查显示Btbd 18在轮状精子细胞期发生减数分裂后阻滞，显著减少圆形精子细胞的形成。
TUNEL分析显示，突变的生精管细胞凋亡显著增加。对突变的生精小管的进一步显微观察表明，生殖细胞在精母细胞晚期开始凋亡。对照和对照减数分裂染色体传播的免疫染色Btbd 18零精母细胞证实在没有BTBD 18的情况下，突触和重组成功。
因为p53通路经常被激活，在应激反应中触发细胞凋亡，所以我们产生了Btbd 18零老鼠在p53零背景。然而，双基因敲除小鼠的精子发生失败。提示p5 3不依赖于p5 3的通路参与生殖细胞的清除。Btbd 18零老鼠。
BTBD18是小鼠睾丸中的粗线核蛋白
调查Btbd 18在精子发生过程中，我们根据以前报道的小鼠rna-seq数据，分析了睾丸内的主要细胞类型。
我们发现Btbd 18从精原细胞到精子细胞均有转录本，成熟精子和支持细胞中均有微量表达。为了进一步研究BTBD 18蛋白在小鼠体内的表达，我们构建了表达BTBD 18的转基因小鼠。
Btbd 18转录起始位点上游3.2kb序列的cDNA作为启动子。将转基因BTBD 18标记为N端标记和C端mCherry标记进行鉴定。我们第一次证明转基因的表达挽救了我们观察到的精子发生和生育缺陷。
Btbd 18零老鼠。这表明Btbd 18是专门针对敲除线的，并且Btbd 18旗/樱桃内源基因的转基因替代物Btbd 18基因。然后我们问到BTBD 18在哪里旗/樱桃蛋白质定位于小鼠睾丸。
虽然新制备的精小管或冷冻睾丸切片中的荧光信号低于检测值，但用抗mCherry抗体对冷冻睾丸切片进行免疫染色，发现粗线精母细胞核内有特异性的免疫荧光。
BTBD 18对粗线piRNA基因座转录伸长的促进作用
为了确定BTBD 18是如何调控其靶向pRNA前体转录的，我们研究了这些基因组位点上的染色质结构。为了检测染色质可达性的变化，我们对新鲜分离的精母细胞进行转座酶可达染色质测序(ATAC-seq)。
在对照精母细胞中，常出现一个以粗线piRNA前体TSS为中心的尖峰，随后出现一个宽峰进入转录单位。在没有BTBD 18的情况下，PP-BD基因体上的染色质结构被严重破坏，支持BTBD 18在调节转录活性而不是转录稳定性方面发挥作用。
然而，尽管BTBD 18缺失，但PP-BD基因TSS周围的染色质区仍可接近，提示BTBD 18在启动子开启后转录机制组装中的调控作用。因此，我们进行了芯片-seq分析，以了解POLⅡ在控制系统中的占用率。
Btbd 18零睾丸细胞。与ATAC-seq结果一致的是，在没有btbd 18的情况下，pp-bd基因座中POLⅡ的延伸明显局限于tsss周围的基因组区。
表示非生产性伸长率.这一结果证明了5‘检查点的存在，因为POLⅡ在早期伸长过程中离开了piRNA前体的启动子，BTBD 18在没有适当的许可信号的情况下停止了转录。
讨论
不同的pRNA前体对BTBD 18的反应提示不同的染色质标志和转录控制在离散的piRNA位点。我们研究了不同的组蛋白修饰三个群体的pRNA前体基因位点。
有趣的是，赖氨酸乙酰化和巴顿化在PP-BI和PP-BD群体中表现出显着性差异，确定BTBD 18是否与这些修饰相互作用，以及BTBD 18与这些修饰的相互作用方式将是很有趣的。
此外，已知含有btb的蛋白质与cullin相互作用，组装E3连接酶并介导蛋白泛素化。这增加了BTBD 18也可能介导组蛋白H2B泛素化以促进RNA POLⅡ的延伸。
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