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自肿瘤的免疫治疗诞生以来，寻找能预测免疫治疗效果的生物标志物就成了科学家们的一个重大难题。如何评价现有的生物标记物也是临床医生、病理学家、科学家、技术人员和各大制药公司所共同面临的一项重要任务。
2021年2月12日，西奈山伊坎医学院的Fred R. Hirsch教授在影响因子53.276分的《Nature Reviews Clinical Oncology》杂志上发表了题为《PD-L1 as a biomarker of response to immune-checkpoint inhibitors》的综述，系统性地为大家介绍了PD-L1作为免疫检查点抑制剂效果的生物标记物的实际效果。学习此文有助于我们从PD-L1这个角度了解目前免疫治疗的实际情况、难题和挑战。
靶向PD-1或PD-L1的免疫检查点抑制剂显著改善了许多类型癌症患者的预后，尽管只有其中20%-40%的患者从这些新疗法中受益。通过免疫组织化学方法定量的PD-L1是目前最为广泛被验证、使用和接受的生物标志物，用于指导患者选择接受抗PD-1或抗PD-L1的治疗。
然而，在这些检测方法的临床应用中仍然存在许多挑战，包括对特定药物使用不同的配套诊断检测方法的必要性，在性能和阈值（cut-off points）方面，检测间（inter- assay）的高水平变异性，以及缺乏每种检测方法诊断出的PD-L1+疾病与临床结果之间的前瞻性比较。
在这篇综述中，我们描述了PD-L1免疫组织化学检测在筛选接受抗PD-1或抗PD-L1抗体的患者时所起的作用，我们讨论了与这些检测相关的各种技术和临床挑战，包括监管问题，并就如何优化PD-L1作为未来实体瘤患者治疗时的选择生物标志物（selection biomarker）提供了一些观点。
- PD-L1检测的临床效用因癌症类型和治疗方案（settings）的不同而有很大差异。
- 特异性PD-L1检测方法的选择应符合目的，并由临床效用决定；检测应针对特定的器官，并根据肿瘤学家和病理学家之间的会诊进行选择。
- 虽然有多种商业PD-L1分析方法可用，但它们在分析性能方面并不相同，考虑到这些差异，在解释结果时应格外小心。
- 分析前（Pre-analytical）和分析性（analytical）因素、评分算法、组织采集的位置和时间都会影响PD-L1检测的结果。
- 对基于实验室的PD-L1检测进行开发和报告作进一步标准化是有必要的。
- 建议对检测性能和外部质量保证计划的参与进行前瞻性内部审阅（review）。
PD-1在肿瘤浸润性免疫细胞上表达，而PD-L1在抗原提呈细胞和肿瘤细胞上表达，两者都是免疫检查点蛋白，可负调控适应性抗肿瘤免疫反应。在许多情况下，PD-L1的表达使肿瘤细胞能够逃避免疫监视。这一观察结果表明，抑制这一免疫检查点可以促进抗肿瘤免疫，从而消除肿瘤细胞，并为进一步将PD-L1的表达发展为抗PD-1（如pembrolizumab、nivolumab和duvalumab）或抗PD-L1（如atezolizumab和avvelumab）抗体应答的预测性生物标志物提供了有力的理论依据。PD-1或PD-L1抗体改变了许多晚期癌症的治疗格局，包括黑色素瘤、肺癌、乳腺癌、肾癌和许多其他癌症。越来越多的研究报道称，这些疗法（相对于以前的标准治疗方法）取得了良好的长期效果；然而，在大多数情况下，只有20%-40%的患者会有反应，疾病获得长期缓解的患者更少。因此，开发一种方法以筛选出能从这些药物中受益的患者群体有着非常重要的作用。我们需要更好地理解原发性和获得性耐药的机制，这两种机制很常见，但也都了解得很少。另外，还必须考虑这些药物的毒性风险，以及在可能有其他有效治疗方法的情况下确保患者不被置于无效治疗的处境。PD-L1的表达可通过免疫组化来（IHC）检测，在肿瘤细胞和免疫细胞上均有发现，但在各种肿瘤类型的患者中，PD-L1表达是一种有用的、但尚不完善的预测抗PD-1或抗PD-L1抗体的生物标志物。在研究nivolumab和atezolizumab的安全性和有效性的最早研究中，证实了PD-L1表达作为预测性生物标志物的潜在效用，为进一步开发PD-L1的表达用于这一用途提供了强有力的理论基础。FDA已经批准了用于评估PD-L1表达的多种检测方法，通常与特定的治疗药物联合使用；并不是所有的检测方法都具有同等的灵敏度和重复性。此外，使用不同的化验方法对同一样本进行分析可能会导致不一致的结果，这可能会对患者是否合适接受抗PD-1或抗PD-L1抗体产生重要影响。在这篇综述中，我们讨论了通过IHC确定PD-L1表达，作为在各种相关肿瘤类型中对抗PD-1或抗PD-L1抗体应答的预测性生物标记物的目前证据水平，重点放在评估方法、技术挑战、监管环境（the regulatory landscape）和未来有可能提高PD-L1表达作为预测性生物标记物的实用性的研究方向上。FDA批准的PD-L1检测分为“伴随性”或“互补性”诊断。FDA将伴随诊断定义为提供“对安全和有效地使用相应药物或生物制品必不可少的信息”的产品。这样的测试有助于医疗保健专业人员确定特定疗法的益处是否可能超过对特定患者任何潜在的严重不良影响或风险，并与特定药物的使用有关。在欧盟，伴随诊断的定义是“对于安全和有效地使用相应医疗产品至关重要的设备，（A）以在治疗之前和/或治疗期间识别最有可能从相应医疗产品中受益的患者；（B）或在治疗之前和/或治疗期间识别可能因使用相应医疗产品治疗而增加严重不良反应风险的患者”。FDA已批准使用三种PD-L1 IHC检测作为辅助诊断：DAKO 22C3（后文简称为22C3）用于治疗各种实体肿瘤患者的帕博利珠单抗（pembrolizumab）；Ventana SP142（后文简称为SP142）用于尿路上皮癌、三阴性乳腺癌（TNBC）或非小细胞肺癌（NSCLC）患者的阿妥珠单抗（atezolizumab）；和DAKO 28-8（后文简称为28-8），用于伊匹单抗（ipilimumab）和纳武单抗（nivolumab）联合治疗非小细胞肺癌（表1）。相比之下，目前还缺乏补充诊断的官方定义；然而，FDA的一份草案建议，补充诊断是“它是用于识别生物标记物所确定（defined）的患者子集（subset）的一种测试，这些患者对药物的反应特别好，并有助于个别患者的风险/益处评估，但这些不是接受药物的先决条件”。在美国，28-8和Ventana SP263（后文简称为SP263）检测被认为是晚期非小细胞肺癌患者使用纳武单抗和晚期尿路上皮癌患者使用duvalumab的互补诊断。这篇文章主要关注FDA已批准的伴随和补充诊断测试，尽管这些批准和要求可能并不是普遍适用的，因为其他地方的监管机构对使用PD-L1作为生物标记物来使用采取了不同的方法。IHC可以评估PD-L1在肿瘤细胞和肿瘤浸润性免疫细胞上的表达，包括巨噬细胞、树突状细胞、中性粒细胞、髓系来源的抑制细胞以及T细胞和/或B细胞。在接受纳武单抗或帕博利珠单抗治疗的病人的临床试验中，使用肿瘤比例评分（tumour proportional score，TPS）或肿瘤细胞（TC）的表达在很大程度上检验了PD-L1表达在肿瘤细胞上的预测能力，其定义是具有部分或完全膜性PD-L1染色的可计数（viable）肿瘤细胞相对于样本中所有可计数肿瘤细胞的百分比（图1）。相比之下，在探索阿妥珠单抗疗效的试验中，使用了SP142试验来评估PD-L1在肿瘤细胞和肿瘤浸润性免疫细胞上的表达。评估肿瘤细胞上PD-L1表达的公式与用于计算TPS的公式相同，而免疫细胞上的PD-L1通常被估计为表达PD-L1的免疫细胞浸润的肿瘤面积相对于总肿瘤面积（图1）。在其他接受免疫检查点抑制剂（ICIs）治疗的研究中，也检测了PD-L1在肿瘤细胞和肿瘤浸润性免疫细胞上表达的预后价值。例如，Keynote-028是一项Ib期研究，在该研究中，接受帕博利珠单抗治疗的晚期实体肿瘤患者，使用22C3检测进行量化后，要求肿瘤或间质细胞有≥1% 可表达PD-L1。类似地，在一项I/II期研究中，晚期尿路上皮癌患者接受Durvalumab单药治疗，使用SP263检测进行量化，发现那些≥25%的肿瘤或免疫细胞上有PD-L1表达的患者可发生更高的应答率。探索性的生物标志物分析随后采用了这一特定的阈值点（cut-off point）。随后开发了一种评分算法，称为综合阳性评分（combined positive score，CPS），其定义为所有PD-L1+细胞（肿瘤细胞、淋巴细胞和巨噬细胞）的总和除以可计数的肿瘤细胞总数（图1）。对于TPS和CPS，当使用22C3和28-8检测时，被评估的切片中必须至少存在100个可计数的肿瘤细胞才达到足以进行PD-L1评分的标准，而当使用SP142检测时，必须至少有50个肿瘤细胞是可用于评估的。而到目前为止，仅发表了两项评估病理学家之间CPS可重复性的研究数据。22C3测试制造商进行的一项研究显示，对胃癌和/或胃食管交界处（GEJ）癌症患者样本的评估总体百分比一致性（overall percentage agreement，OPA）为96.6%。然而，一个独立研究小组的结果表明重复性较差，分别使用22C3和SP263检测法，CPS ≥ 1的组内相关系数分别为0.39和0.26，CPS ≥ 10的组内相关系数分别为0.23和0.14。这些结果表明，在常规临床应用该系统之前，还需要对执业病理学家的CPS的重复性进行更多的研究和/或对他们作进一步培训，该系统目前仍是PD-L1评估的次优方法。考虑到在Blueprint II期研究中对TC和肿瘤浸润性免疫细胞（IC）评分的独立评估显示TC评分的一致性很高，ICC为0.86-0.93，而IC评分显示观察者间的可重复性较差，ICC为0.18-0.19，因此提高CPS在研究人员间的一致性水平可能个有挑战性的工作。除了TC和IC评分系统，PD-L1在特定免疫细胞群体中的表达也可能是预测ICI反应的一个潜在生物标志物，这也是一个活跃的研究领域。例如，在NSCLC患者中，CD68+巨噬细胞被确认为肿瘤和间质中表达PD-L1最显著的细胞，巨噬细胞中PD-L1的高表达与NSCLC患者的总生存期（OS）显著延长相关，而肿瘤细胞PD-L1的高表达与此无关。随着ICIs试验的开展，肿瘤PD-L1的表达已逐渐演变成了一种选择标准。最初，试验招募了一些与PD-L1状态无关的患者。事后的分析表明PD-L1水平较高的患者的反应有所改善后，部分试验通过限制那些肿瘤细胞PD-L1表达水平很低的患者的入组来提高反应率。肺癌患者的试验证明了这种基于PD-L1状态进行选择的趋势；在接受帕博利珠单抗治疗晚期非小细胞肺癌患者的I期Keynote-001试验中，PD-L1 TPS为50%的患者的应答率为45.2%，而TPS为1-49%和<1%的患者的应答率分别为16.5%和10.7%，所以FDA加快了对PD-L1 TPS >1%的患者使用帕博利珠单抗的批准速度。在一项涉及相同患者群体II/III期的后续研究中也得到了证实，即在TPS为≥50%的患者中观察到了治疗效果的进一步改善。FDA还批准Pembrolizumab作为这种情况下的一线治疗方法，此前一项III期研究比较了Pembrolizumab与以铂为基础的化疗治疗效果，结果显示Pembrolizumab在无进展生存期（PFS）和OS方面都有显着改善。到2016年秋季，根据肿瘤细胞PD-L1的表达水平，Pembrolizumab被FDA批准用于一线和二线治疗。然而，在后期试验中nivolumab和atezolizumab的试验未能表明PD-L1状态和治疗结局之间有足够强的相关性，因而并不能证明使用PD-L1 IHC分析作为必需的（伴随性）诊断是合理的。这些试验结果的差异，以及人们意识到一部分PD-L1阴性的肿瘤患者可以从ICIs中受益，共同推动了人们对PD-L1作为临床生物标记物的普遍怀疑。在上述2016年FDA批准之后，病理学家开始质疑他们自己是否有能始终如一地做出支持这种生物标记物驱动的方法所需的准确的半定量判断。尽管染色步骤标准化，并将pembrolizumab配套诊断（22C3）和其他补充诊断分析包装为商业试剂盒，但许多研究表明，做出解释的病理学家之间也存在很大程度的差异。病理学家之间的OPAs会根据定义的截断点而不同，TPS为1%时，OPAs从76%到84%不等，TPS为50%时，OPAs从76%到82%到>94%不等。在一项比较6个病理学家和5个商业PD-L1检测结果的研究中，在0-20%的样本（TPS为1%）和0-5%的样本（TPS为50%）中，个别病理学家的得分偏离了共识。在另一项研究中，比较了10位病理学家使用22C3分析解释非小细胞肺癌样本的表现，在1%和50%的分界点上，观察者内部的OPA均为90%。公认的协议措施是有争议的。90％的检测间一致性是美国病理学家学会进行IHC测定验证的拟定基准，临床试验中生物标记物的开发可能需要观察者间（interobserver）的至少有0.6或0.8（Cohen's Kappa）一致性。尽管有这一建议的、可接受的一致性水平，病理学家在TPS为1%且多达25%的样本中对PD-L1 TPS评分持不同意见的临床意义尚不清楚。这一点不应该被解释为对病理学家能力的谴责，而是应该提醒人们对于人类感知的极限，和对那些位于复杂视觉环境中的生物标记物进行精确定量测量的能力极限。事实上，22C3检测在市场上销售时被明确作为定性检测，尽管制造商根据临床适应症提供了对肿瘤细胞和免疫细胞表达进行相对定量的指南。FDA最终批准帕博利珠单抗用于转移性非小细胞肺癌患者和PD-L1TPS≥1%的患者，尽管PD-L1表达水平较低的患者，其存活率仍相对较低。相比之下，EMA拒绝在这种情况下批准pembrolizumab，因为在PD-L1评分为1-49%的患者中，帕博利珠单抗缺乏相对于化疗的明确优势。虽然不是为了批评EMA的决定，但FDA的批准使临床医生能够决定PD-L1表达水平处于低到中等水平的患者的治疗过程，因为他们现在可以选择单独接受ICI或ICI加化疗。这种方法也促使病理学家提供一个定量的而不是分类的（高或低）PD-L1评分，因为PD-L1的表达是一个连续变量，而且TPS为1%相对于TPS为40%似乎有着不同预测意义，即使这两个评分都被归类为“弱阳性”。许多病理评分系统认识到病理学家无法基于视觉评估来提供精确的定量测量，因此强调半定量的方法，将其分为5%或10%的增量。目前对PD-L1评分的最佳报告实践缺乏明确的指导；然而，在我们看来，以5%或10%的增量来报告TPS的方法向临床医生提供的报告可能是最合适的，同时避免像'TPS=46%’这样人为精确度的评分。TPS>90%的NSCLC患者的客观有效率（ORRS）、中位PFS和中位OS都明显好于TPS为50-89%的患者。这些数据结果还没有被广泛推广，尽管如果不以半定量的方式来记录TPS评分，那么研究'PD-L1+’癌症患者的不同治疗反应将会是不可能的。最后，更精确、更定量的PD-L1评分方法，无论是对肿瘤细胞还是免疫细胞，都可能受益于数字病理学和自动图像分析。这样的方法必然需要重大的基础设施升级，至少需要广泛的分析和技术验证，以建立起与病理学家评估结果之间的一致性。对新辅助治疗前后样本免疫微环境中PD-L1表达的探索性分析已经证明了多重（multiplexed）成像和自动化分析的可行性；然而，还需要对所有相关治疗设置进行前瞻性的临床验证。在开发抗PD-1和抗PD-L1抗体的过程中，每个制药公司都在追求开发自己独特的诊断抗体和相应的PD-L1染色和解释方案。这种脱节的方法在将PD-L1发展为跨不同肿瘤类型的通用预测生物标记物时成了一项重大挑战。为了阐明最常见的诊断性PD-L1检测之间分析的异同，我们进行了蓝图PD-L1 IHC检测比较项目（图2，3）。这项比较性的分析研究表明，28-8（BMS；nivolumab）、22C3（默克；帕博利珠单抗）和SP263（阿斯利康；durvalumab）检测在基于TPS且不考虑强度的肿瘤细胞染色方面具有类似水平的表现，而SP142（基因泰克/罗氏；atezolizumab）检测灵敏度较低。这项研究还显示免疫细胞染色比肿瘤细胞具有更大的测定间变异性。这些发现与一项前瞻性的多机构NCCN研究一致，该研究比较了22C3、28-8、SP142和CellSignaling 的E1L3N检测的性能，并发现SP142的灵敏度低于其他三种检测方法。这项研究还证实了病理学家对肿瘤细胞评估的一致性水平，但在免疫细胞的PD-L1表达方面却没有。在随后的第二阶段蓝图研究中，Dako 73-10检测（辉瑞/默克血清；Avelumab，后来称为73-10）被添加到被分析的检测组中，并被发现相对于其他检测方法， 73-10在肿瘤细胞染色方面具有更高的灵敏度。在2020年4月发表的一项研究中，73-10的性能与22C3的性能进行了比较，发现在22C3的≥50%的PD-L1表达和73-10在≥80%的阈值下相似。因此，对于PD-L1表达值不满足这些阈值的样本，两种检测方法就不具有可比性。尽管做出了不少努力来评估现有检测方法的分析特性以及操作者间的可变异性程度，但目前还缺乏在不同检测方法之间以及不同抗PD-1或抗PD-L1抗体之间的治疗结果的临床比较，尽管这些检测方法显然不是通用的、可互换的。正在进行的回顾性研究就是比较基于SP142或22C3分析选择接受阿妥珠单抗治疗的患者的临床结果。不同PD-L1 IHC平台的独特要求是使用限定的自动染色机。例如，22C3化验需要使用自动染色器Link48，而当这种化验方法首次出现时，病理实验室还并没有广泛使用这种化验方法。因此，许多实验室使用其他染色平台，如实验室开发试验（LDT）。在2019年8月发表的一项分析中，将LDTs 的性能与AutoStaner Link 48的性能进行了比较，得出的结论是：协调是可能的；尽管如此，依然缺乏比较临床结果的相关数据。同样，由同一研究小组对不同PD-L1检测性能所进行的大型meta分析得出结论，当检测实验室不能将FDA批准的评估PD-L1的伴随诊断用于其特定临床目的时，为相同目的使用适当验证的LDT比用FDA所批准的另一种针对不同目的开发的伴随诊断更有效。总之，这些研究表明，三种PD-L1检测方案（28-8、22C3和SP263）具有相似的分析性能，可以互换使用。Blueprint第二阶段研究还显示，在20多名受过专业培训的国际公认病理学家中，28-2、22C3、73-10和SP263在所有表达水平的肿瘤细胞染色的解释中具有很高的重复性，在1%的分界点上的一致性则略低。然而，PD-L1在免疫细胞上的重复性明显低于在肿瘤细胞上的重复性。此外，还需要对LDTs 与FDA定义的方案进行进一步的临床比较研究。在实践中，用于诊断和生物标记物测试的肿瘤活检取样是由病变大小、易获取程度及其能提供临床分期信息的可能性来共同驱动的。对于许多患者来说，即使是在多发转移的情况下，也只会采样一个病灶。活检取样的方法也各不相同，包括手术切除、转移瘤切除、芯针活检取样和细针抽吸。一般来说，检测ICIs的临床试验并不强制使用从原发灶和转移灶获得的活检样本。因此，大多数与这些试验相关的生物标记物研究必然包含样本位置和类型的异质混合。然而，当临床医生确实可以获得多个不同的活检样本时，他们应该如何选择最佳样本进行生物标记物测试则仍然不清楚。最优样本的定义仍然是一个重要的问题：它是最具代表性的样本，还是最有可能产生阳性PD-L1结果的样本？尽管有一些经验数据可以指导这一决定，但这些问题大多仍未得到解决。较老的样本似乎不是评估PD-L1的可靠材料来源。在ATLANTIC试验中，曾接受药物治疗的晚期非小细胞肺癌患者接受了Durvalumab治疗后，3年以上的样本PD-L1阳性率明显降低，其中PD-L1采用SP263量化，肿瘤评分>25%将被定义为阳性。在一项使用PD-L1研究抗体9A11的单中心研究中也观察到了类似的结果。此外，较老的样本可能不再能准确地反映出患者肿瘤的免疫学状态，从而不能准确反映他们从ICIs中受益的可能性。对非小细胞肺癌和尿路上皮癌患者原发灶和转移灶的标本进行PD-L1免疫组化检测，结果显示一致性为75-88%，尽管这类研究经常受到采样间的时间和治疗间隔的干扰。例如，在NSCLC患者中，来自原发肿瘤和脑转移病灶的配对样本的肿瘤（但不是免疫细胞）PD-L1的表达存在正相关。然而，在另一项研究里，采用PD-L1表达最小阈值点采用5%时，有14%的配对样本被发现在肿瘤细胞的PD-L1表达不一致，这些样本获取之间的中位间隔为11个月。据报道，有22%的NSCLC患者尽管在同一时间点进行了切除，并且没有进行新辅助治疗，PD-L1的表达在原发肿瘤和纵隔淋巴结转移灶之间仍然存在差异。在本研究中，PD-L1的状态在相同频率的位点之间从正（定义为H-Score>1）转变为负（反之亦然）。相比之下，乳腺癌患者转移瘤中肿瘤浸润淋巴细胞的数量和PD-L1的表达（肿瘤或免疫细胞上的）均明显低于原发肿瘤样本。在对来自非小细胞肺癌患者的大量未配对样本的分析中，肝和肾上腺转移瘤的PD-L1表达水平往往高于脑和骨转移瘤。对不同时间点获得的配对样本所进行的几项分析提供了一致的结果（从67-74%的样本），尽管导致这种差异表达的临床因素充其量是部分确定的。PD-L1的表达在接受ICI或其他治疗后可能会改变，这取决于所接受的特定治疗和原发肿瘤组织学特征。经ICI或新辅助化疗后，NSCLC肿瘤细胞上PD-L1表达降低。据报道，化疗不会影响尿路上皮癌中PD-L1的表达，但这方面的研究有限。在非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）和尿路上皮癌肿瘤标本的连续切片中，肿瘤细胞上PD-L1的表达似乎高度一致。然而，瘤内异质性是一个公认的挑战，它可能会搅乱小样本中PD-L1表达的测定。在非小细胞肺癌（NSCLC）标本中，PD-L1表达的异质性在某些情况下可归因于侵袭性的程度，表现为在肺腺癌标本中，PD-L1在胚层（lepidic）生长成分中相对缺乏表达，而在肉瘤样成分中相对高表达。在许多情况下，PD-L1表达的显著位置差异不能仅仅通过形态学上的差异来解释；亚克隆基因组、转录或表观基因组进化都可以促进免疫逃逸，也可能解释PD-L1表达在肿瘤内的差异。鳞状非小细胞肺癌的PD-L1表达水平通常比腺癌更为均匀，尽管文献中的报道各不相同。一项使用SP142检测PD-L1 TC和IC评分的研究发现，来自诊断活检样本和非小细胞肺癌患者明确切除样本的配对材料之间有48%的不一致，其中75%的差异是由IC评分的差异造成的。细胞学样本通常不用于临床试验，尽管此类样本在临床实践中经常被广泛用于诊断和生物标记物测试，并且在使用PD-L1 TPS进行评估时与手术标本高度一致，但它们不能稳定地产生IC评分。无论样本类型如何，适当性要求每个样本至少有100个肿瘤细胞，用于22C3和28-8检测的PD-L1染色，以及至少50个肿瘤细胞用于SP142。这些数字不一定是由临床结果驱动的，尽管研究表明，当至少一个样本含有<100个肿瘤细胞时，多个样本之间PD-L1评分的一致性较差，而且这种有限的细胞密度可能导致对TC评分估计的不准确。基于液体活检分析的分子诊断，例如使用循环游离肿瘤DNA的活检，正迅速被采用为SOC诊断的一部分。一些较小的队列研究试图评估循环肿瘤细胞（CTC）上PD-L1的表达；在一项NSCLC患者的研究中，使用28-8抗体在49名患者中的28名患者（67%）的样本里检测到PD-L1的表达。然而，需要更大队列的前瞻性研究来评估CTC上PD-L1表达的预测价值。多个分析前变量会影响IHC分析的可靠性，包括冷缺血时间（定义为从样本采集到组织固定的时间）、固定剂类型、固定时间和是否脱钙（如对骨骼样本）。延长冷缺血时间，使用无缓冲福尔马林，以及固定时间不足或过长都会导致组织抗原性减弱，并增加假阴性结果的风险。含盐酸的脱钙剂似乎降低了PD-L1的检出率（detectability），而螯合剂或含甲酸的脱钙剂不会。与PD-L1不同，大多数蛋白IHC检测，包括用于筛选患者进行内分泌治疗或曲妥珠单抗的配套诊断测试，都可以互换使用。虽然不一定是相同的，但这些检测方法，以及经常使用它们的LDT，具有相似的灵敏度和检测阈值。然而，这一观察结果对PD-L1并非如此，对于PD-L1，几项研究的数据显示SP142检测的灵敏度低于其他检测方法。这两种检测方法之间的差异要求病理学家要么进行多次检测，要么与临床肿瘤学家商量他们计划开出哪种ICI，这样就可以选择匹配的配套诊断测试。化验的差异敏感性也给化验的验证带来了挑战，到目前为止，供应商基本上忽略了这一点。具体地说，SP142检测的制造商建议病理学家首先对扁桃体或淋巴结切片进行验证，在那里读片的人应该会看到“信号”，但并不考虑强度；在任何一天，染色可能会更深或更浅，就会导致超过检测强度阈值的病例数量增加或减少。同样，推荐用22C3或28-8检测验证方法时，使用的是高表达PD-L1的细胞系，这意味着阈值会在不同的检测过程中可能会再次发生变化。虽然没有通用的检测协调解决方案，但我们提出了一种解决验证问题的方法。在以前的研究中，我们使用细胞系来评估PD-L1检测的差异敏感性。我们建议使用这些细胞系中选定的一个子集作为所有检测的阈值敏感验证方法，尽管阈值有所不同。使用一个或多个细胞系作为阴性对照，以及用其他合适的细胞系作为低阳性、中阳性和高阳性对照，以使每种分析的阈值都能得到验证（图4）。对于SP142，左边的两个斑点应该是阴性的，但是右边的两个斑点应该显示信号，而对于所有其他的分析方法（SP263，22C3，28-8和类似灵敏度的LDT，如E1L3N），最左边的斑点应该是阴性的，而其余的斑点应该是阳性的。这种方法对于普通实验室来说可能太复杂了，尽管我们预计很快就会有类似于这张图片的商业产品问世。抗PD-1和抗PD-L1抗体改变了NSCLC的治疗格局，特别是对于局部或晚期疾病的患者，其肿瘤缺乏可靶向的驱动改变。尽管如此，PD-L1表达作为预测性生物标记物的作用随着时间的推移也发生了改变，对需要一线治疗的患者和需要后期治疗的患者有不同的影响。PD-L1 IHC作为一种预测性生物标志物在指导晚期非小细胞肺癌患者一线治疗方面最具实际意义。Keynote-024使用22C3试验，随机将未接受治疗的晚期非小细胞肺癌患者和PD-L1 TPS为≥50%的患者分配接受pembrolizumab或化疗，确定了接受pembrolizumab的患者的OS获益。因此，PD-L1 IHC成为在一线治疗方案下识别可能受益于pembrolizumab治疗的患者的标准方法。但对于PD-L1 TPS<50%的肿瘤患者，一线单药ICIs的益处就不那么明显了。在Keynote-042中，它的设计与Keynote-024型相似，但入选的患者TPS≥1%，在所有TPS人群（≥为50%、≥为20%和≥为1%）中均可观察到pembrolizumab对OS的益处。这种益处似乎随着TPS的增加而增加；中位数OS随着PD-L1表达的增加而延长，导致风险比（HR）降低，尽管有重叠的95%可信区间（CI）。此外，对肿瘤TPS为1-49%的患者的数据进行了探索性分析，表明与化疗相比，这一亚组可能没有从帕博利珠单抗中获益。尽管如此，正如前面所讨论的，FDA批准了PD-L1 TPS为1%的PD-L1TPS患者使用单药pembrolizumab，从而为患者提供了一种省去化疗的选择，而EMA 拒绝这样做。在肿瘤PD-L1表达水平较低（TPS<50%）的患者中，目前尚无前瞻性数据比较ICI单一疗法和ICI加化疗的疗效。根据IMpower 110的数据，atezolizumab也已被批准作为晚期非小细胞肺癌患者的一线单一疗法，数据显示，与肿瘤细胞上≥50% PD-L1表达和/或免疫细胞上≥10% PD-L1表达的化疗相比，接受一线治疗的患者的中位OS有所改善。如上所述，就灵敏度而言，SP142的分析结果通常是一个离群值，病理学家无法使用该化验一致地评估免疫细胞染色，这一问题很可能会在FDA批准SP142化验作为这种情况下的伴随诊断后出现。此外，许多NSCLC是通过细胞学标本诊断的，而从淋巴结中获得的标本并不少见，这就提出了一个问题，即如何在现实世界中以最佳方式解释免疫细胞PD-L1的表达。当ICIs与化疗联合使用时，PD-L1的高水平表达并不会改善治疗有效率，这表明化疗可能会增加肿瘤的免疫原性，并使PD-L1作为预测性生物标记物的价值降低。来自多个大型队列研究数据已经证明，在晚期非小细胞肺癌患者中，一线抗PD-1或抗PD-L1抗体联合化疗比单独化疗的疗效更好。尽管如此，无论PD-L1表达如何，TPS ≥1%的患者都能看到这些益处，并且不会随着PD-L1表达的增加而增加（除了与卡铂和nab-紫杉醇联合使用的atezolizumab外）。在CheckMate 227试验中，未接受治疗的晚期非小细胞肺癌患者接受nivolumab加ipilimumab治疗，与单纯化疗相比，接受ICIs治疗的患者无论PD-L1 TPS<1%或≥1%，其OS都有改善。尽管有这些结果，FDA仍然只批准将ipilimumab和nivolumab联合应用于TPS为≥1%的患者，这是该研究的主要终点。在PACIFIC试验中，对于局部晚期、无法切除的非小细胞肺癌患者，与安慰剂相比，使用durvalumab的患者的OS获得改善，因此durvalumab被批准为最终化疗放疗后的维持疗法。来自一项探索性的事后分析结果显示，使用SP263检测，那些PD-L1 TPS<1%的患者的OS并没有改善；然而，这是一项计划外的分析，没有使用传统的1%或50%的分界值。在大多数国家，患者选择接受Durvalumab的维持治疗时不要求PD-L1状态，尽管EMA只批准了TPS ≥1%的肿瘤患者使用这种治疗，而FDA根据初步分析批准了Durvalumab，而不要求PD-L1表达。还有几个问题仍然存在。在美国，PD-L1 TPS为1-49%或≥50%的患者可以接受pembrolizumab治疗或接受ICI联合化疗；TPS为≥50%的患者也有资格接受atezolizumab治疗。许多临床医生会继续对TPS >50%的患者进行ICI单一治疗，尽管在这种情况下，对于能够并愿意耐受化疗的患者，ICI和化疗的组合也不是不正确的；对于TPS为1-49%的患者，情况正好相反。正在进行的SWOG INSIGNA研究（NCT03793179）旨在比较这些方法，根据PD-L1 TPS对患者进行分层，试图解决这个问题。除了FDA对非小细胞肺癌的各种批准外，ICIs还被批准用于小细胞肺癌（SCLC）的治疗。在这种情况下，PD-L1的表达似乎不是一个可用于预测的生物标志物，而且PD-L1在小细胞肺癌肿瘤细胞上的表达很少，免疫逃避通常是通过其他机制实现的，包括下调MHC抗原复合物的表达。2018年8月，根据I/II期Check Mate 032期试验的结果，nivolumab被批准为转移性小细胞肺癌患者的三线治疗药物。虽然在这项试验中，肿瘤细胞PD-L1的表达与临床获益无关。因此，FDA的批准与PD-L1无关。自2019年以来，FDA已经批准一线atezolizumab、pembrolizumab和durvalumab联合化疗用于晚期小细胞肺癌患者。因为PD-L1的表达不能预测在这种情况下的反应，FDA批准的每种组合也并不依赖于肿瘤细胞PD-L1的表达。在黑色素瘤中，PD-L1在肿瘤细胞上的表达程度因组织学亚型的不同而有很大差异，其与预后的关系仍不确定。然而，PD-L1的表达与抗肿瘤免疫的证据呈正相关，通过使用IHC或mRNA signature鉴定的特定免疫细胞类型，结果表明PD-L1在黑色素瘤中的表达反映了适应性抗肿瘤免疫反应的情况。尽管PD-L1的表达与ICIs的临床获益之间可能存在关联，以及FDA在2016年批准28-8 PharmDx检测作为补充诊断，但PD-L1阴性的晚期黑色素瘤患者并不被排除接受抗PD-1或抗PD-L1抗体。这一设想可能反映了多种因素的组合，包括试验设计、PD-L1表达模式、数据解释以及ICIs相对于历史性SOC的优越性。例如，在一项III期研究中，使用28-8检验来确定5%的PD-L1阳性阈值点，比较了nivolumab和达卡巴嗪（dacarbazine）对未接受治疗的转移性黑色素瘤患者的疗效，PD-L1+肿瘤患者的ORR为52.7%，PD-L1-肿瘤患者的ORR仍为33.1%。在另一项III期研究中，晚期黑色素瘤患者被随机分配到pembrolizumab组或抗细胞毒性T淋巴细胞抗原4（CTLA-4）抗体ipilimumab组，结果显示，接受pembrolizumab治疗的PD-L1+肿瘤患者的OS有所改善（用22C3试验，以≥1%为阳性），而PD-L1阴性肿瘤患者OS的95% CI超过1。然而，后者只包括20%的患者，而且由于其CI较宽，这一发现的意义尚不清楚。PD-L1的表达可能对指导晚期黑色素瘤患者使用nivolumab单一疗法而不是nivolumab加ipilimumab的决定有临床实用价值。在III期研究中，患者接受nivolumab+ipilimumab与nivolumab或ipilimumab单独治疗，与单独使用ipilimumab的PD-L1+黑色素瘤患者（根据28-8 pharmDx检验定义为≥5%）相比，使用nivolumab方案可获得更好的PFS和OS；尽管如此，在PD-L1+肿瘤患者中，nivolumab单一疗法和联合疗法的OS持续时间相似。值得注意的是，ROC分析显示曲线下面积勉强大于0.5，这表明，在这种情况下，单独使用PD-L1的表达并不能很好地预测联合治疗或nivolumab单一治疗的反应。基于相似的OS数据，PD-L1的表达可能被用来支持PD-L1 TPS≥5%的肿瘤患者选择nivolumab 治疗，而不是nivolumab 加ipilimumab治疗，以避免与联合治疗有关的更高毒性风险。与黑色素瘤相似，PD-L1表达缺失并不会排除肝细胞癌（HCC）患者仍接受抗PD-L1抗体治疗。2020年5月，FDA批准atezolizumab加bevacizumab用于不能切除或转移性肝癌患者，这些患者之前没有接受过系统治疗，且无论PD-L1状态如何。这一决定是基于IMbrave150的数据做出的，这是一项III期试验，结果表明与酪氨酸激酶抑制剂索拉非尼相比，使用atezolizumab加bevacizumab作为一线治疗可以改善PFS和OS。早期Ib期试验和其他研究也没有仅根据PD-L1状态来招募患者；因此，PD-L1状态对肝癌患者使用抗PD-L1抗体或联合治疗疗效的预测价值尚未进行前瞻性研究。在一项预先计划的探索性分析中，使用Keynote-244的数据回顾了PD-L1表达水平与pembrolizumab反应之间的关系。Keynote-244是一项II期研究，评估了pembrolizumab在疾病进展或不能耐受索拉非尼的晚期HCC患者中的疗效。在部分患者中，用CPS定量的PD-L1与pembrolizumab的疗效相关，而用TPS定量的PD-L1则不相关，提示有必要进一步研究PD-L1在预测晚期HCC患者对抗PD-1抗体的疗效方面的临床应用价值。因此，PD-L1目前不是FDA批准在HCC患者中使用ICIs或含ICI方案的组成部分。PD-L1在乳腺癌患者中的表达作为生物标志物有着复杂的历史，将其纳入临床实践仍然具有挑战性。在撰写本文时，FDA对ICIs的批准仅限于晚期TNBC。使用SP142型试验，Atezolizumab与nab-紫杉醇一起或不与nab-紫杉醇一起使用，被批准用于PD-L1 IC评分≥1的局部晚期或转移性肿瘤患者。这一决定是基于Impersion 130研究的数据，该研究显示，与nab-紫杉醇加安慰剂相比，这种组合改善了PFS。这一获益引人注目，尽管在肺癌标本的分析中以及随后在TNBC的背景下，所使用的分析被证明是不可重现的，这一事实令人担忧。事实上，一项对19位病理学家进行的TNBC PD-L1评分一致性调查显示，当使用SP142检测时，平均有58%的样本被认为是PD-L1+（范围为40-80%），而使用SP263检测时，平均有78%的样本被认为是PD-L1+（范围为64-96%）。Keynote-355证实了ICI联合化疗治疗转移性TNBC的优势，该研究用22C3试验，将PD-L1阳性定义为CPS>10，并比较了在以前未经治疗的局部复发、无法手术或转移性TNBC患者中，一线pembrolizumab加化疗相比单独化疗的优越性。与单纯接受化疗的患者相比，接受pembrolizumab联合化疗的患者PFS显著改善。这一组合在2020年获得了FDA的加速批准，要求对一线治疗的患者使用不同的检测方法和不同的评分系统。因此，TNBC可能会对配套诊断化验的测试提出特殊的挑战。FDA加速批准使用化疗加pembrolizumab，并使用Keynote-355中采用的22C3伴随诊断测试作为生物标记物，这给患者管理带来了前所未有的问题。以前的研究表明，22C3和SP142检测的性能并不相同，这些试验中使用的评分系统也不同。为了进行正确的检测，病理学家要么必须提前知道肿瘤学家的治疗计划，要么同时进行两种检测，这可能会提供不一致的结果。此外，在这两种情况下，这些化验的重复性都有问题。22C3试验的CPS评分被验证CPS阈值需>1，但在HNSCC患者中，CPS>20也没能得到验证。Keynote-355中使用的CPS>10既没有经过验证，也没有进行独立评估。也许最大的希望是，更新、更客观、更标准化的化验方法最终将取代这些非标准化化验方法。2016年，FDA批准pembrolizumab或nivolumab作为单一疗法，用于在一线铂类化疗后病情进展时复发和/或转移性且PD-L1状态未知的HNSCC患者。Pembrolizumab的加速批准是基于多中心Keynote-040随机III期试验的完成，该试验证明了pembrolizumab优于SOC疗法。Keynote-040和Checkmate 141都证明了pembrolizumab和nivolumab在OS方面都提供了类似的益处，并评估了与SOC化疗相比的1年存活率。在Keynote-040中，使用了22C3检测，pembrolizumab的受益与PD-L1 CPs ≥1相关，而对于CPS值<1的患者没有任何益处。此外，≥50%的患者使用pembrolizumab治疗时死亡HR为0.53（保护因素）。即使有了更高的临界值，对于肿瘤TPS<50%的患者也看不到任何好处。值得注意的是，在确认的治疗有反应者中，pembrolizumab的中位反应持续时间>18个月，并且与PD-L1的表达相关，而化疗为5个月。相比之下，Checkmate 141的数据显示，与SOC疗法相比，使用nivolumab对改善OS有好处，而不管使用28-8 pharmDx 试验确定的PD-L1状态如何。在Keynote-040中进行的相关生物标记物研究推动了Keynote-048的进展，这是一项III期试验，在这项试验中，未接受治疗的转移和/或复发的HNSCC患者被随机分配到单独使用pembrolizumab、pembrolizumab加化疗、西妥昔单抗加化疗；患者根据22C3分析确定的PD-L1 CPS进行分层。与西妥昔单抗加化疗相比，pembrolizumab和化疗的联合治疗改善了OS，与PD-L1状态无关。pembrolizumab治疗在总体人群中并不逊色于化疗，尽管在≥1这一CPS临界值中可以看到OS的显著改善，但pembrolizumab单抗治疗在总体人群中并不逊色于化疗。这项试验的结果推动了FDA批准一线pembrolizumab治疗CPS ≥1的HNSCC 患者或联合化疗治疗PD-L1阴性的肿瘤患者；22C3试验也被批准作为这种情况下的伴随诊断。目前的临床指南建议，对于CPS ≥1的患者，单独使用一线pembrolizumab；对于复发和/或转移的HNSCC患者，无论CPS 如何，联合使用铂类化疗；对于使用铂类治疗方案且没有在一线治疗中接受ICIs治疗的病情恶化的患者，不管PD-L1状态，建议在二线治疗中使用pembrolizumab或nivolumab。关于PD-L1在上消化道癌症患者中表达的文献结果仍然是相互矛盾和异质的。大多数胃腺癌患者的研究报道了PD-L1在肿瘤细胞和免疫细胞膜上的表达，并将其归因于其临床意义，而对食管鳞状细胞癌（ESCCs）患者的研究更多地集中在肿瘤细胞的表达上。在多项回顾性队列研究中，已报道的胃癌患者的PD-L1 CPS值范围很广，从17到72，这与PD-L1检测方法和对PD-L1+的定义存在异质性有关。人们试图将PD-L1的表达与胃癌的特定分子亚型联系起来，尽管这种异质性使得随后的数据在很大程度上是不确定的。一些研究报道PD-L1在肿瘤细胞和/或肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）中的表达与预后不良有关，而另一些研究则报道结果相反或没有预后相关性。尽管缺乏一致的数据，PD-L1的CPS正在成为胃癌和GEJ癌症患者对ICIs反应的生物标记物。在一项单臂II期研究中，曾接受过晚期胃癌或GEJ腺癌治疗的患者接受pembrolizumab治疗，CPS值≥1的患者的ORR（客观缓解率）值为15.5%，而CPS值<1的患者的ORR值为6.4%，使得FDA加速批准该药在22C3试验CPS值≥1的患者中作为三线药物（表1）。随后的III期试验（KEYNOTE-061）未能证明在相同的环境下，使用pembrolizumab与SOC化疗相比，OS得到了改善，尽管pembrolizumab似乎耐受性更好。在一线治疗中，来自Keynote-062中的数据表明，在PD-L1 CPS值为≥1的初治患者中，以铂为基础的化疗加pembrolizumab并不比单独化疗差，而优于那些CPS值≥10的患者。值得注意的是，这些数据并没有使得FDA批准将pembrolizumab作为治疗CPS值≥10的胃癌和/或GEJ腺癌患者的一线治疗方案，对于CPS≥1的患者，pembrolizumab的可用性仍限于三线治疗。PD-L1 TPS似乎是ESCC患者预后和预测的生物标志物。来自多项研究的数据表明，在这些患者中，较高的TPS与较差的预后相关，尽管这并不是一个普遍的发现。然而，PD-L1 TPS似乎可以预测帕博利珠单抗的益处。在Pembrolizumab在接受预处理的食管癌或腺癌患者中的单臂研究中，使用22C3PharmDx试验的PD-L1CPS值为10的患者的ORR（14%）比≥<10的患者（6%）有所改善。此外，一项比较二线帕博利珠单抗与化疗疗效的III期随机试验显示，CPSCPS10的患者的OS得到了改善，导致≥批准了这一设置（表1）。FDA批准了五种不同的抗PD-1抗体（duvalumab、nivolumab和pembrolizumab）或抗PD-L1抗体（atezolizumab和avelumab）用于不能切除的、局部晚期或转移性尿路上皮癌患者，且无论PD-L1的表达如何。然而，在测试nivolumab、atezolizumab和durvalumab的II期研究和测试pembrolizumab的III期研究中，探索性分析结果显示，肿瘤细胞PD-L1的表达（使用28-8试验的nivolumab）、免疫细胞PD-L1表达（使用SP142的atezolizumab）、以及肿瘤细胞和免疫细胞PD-L1表达组合（使用22C3的pembrolizumab和使用SP263的durvalumab）水平较高的患者的ORR持续较高。FDA还批准将一线atezolizumab和pembrolizumab用于根据单臂II期IMLIGN210和Keynote-052试验，对那些不符合顺铂或铂类化疗条件的未经治疗、无法切除的局部晚期或转移性尿路上皮癌患者采用一线药物atezolizumab和pembrolizumab。在IMLIGN210中，使用SP142检测后PD-L1免疫细胞评分不同的患者的ORR没有显著差异。在Keynote-052中，尽管在PD-L1 CPS所有类别的肿瘤患者中都观察到了反应，但在训练集和验证集中都发现ORR和PD-L1 CPS值之间存在正相关；因此，FDA最初在该设置中的批准药物使用不受PD-L1表达的限制。然而，随后对这些药物的验证试验发现，PD-L1表达水平低且接受ICI的患者，与接受铂类化疗的患者相比，其生存结果更差。因此，FDA将atezolizumab和pembrolizumab的批准限制在IC ≥5%、CPS ≥10且不适合顺铂治疗的患者（表1）。2020年6月30日，FDA批准Avelumab作为一线铂类化疗后无疾病进展的局部晚期或转移性尿路上皮癌患者的维持治疗。这一决定是基于JAVELIN Bladder 100试验的结果，其试验结果表明，与最佳支持性治疗相比，使用Avelumab维持治疗的患者OS显著改善，PD-L1+疾病患者的改善更大。有趣的是，在这项试验中，PD-L1的表达是用Ventana SP263法进行评估的，它使用了一个相当复杂、独特的公式，将PD-L1在肿瘤细胞和免疫细胞上的阳性情况结合起来。PD-L1阳性定义为：≥25%的肿瘤细胞PD-L1染色阳性；另外，如果>1%的肿瘤面积含有免疫细胞，则需≥25%的免疫细胞PD-L1染色为阳性，如果只有<1%的肿瘤面积含有免疫细胞，则需100%的免疫细胞PD-L1染色为阳性。由于各个病理实验室所面临的挑战，它们必须进行多项PD-L1 IHC检测，以筛选可能符合各种ICIs的患者，因此需要额外的努力来协调和简化尿路上皮癌患者的PD-L1检测算法。许多含ICI的联合方案可作为晚期肾透明细胞癌（RCC）患者的一线选择，包括ipilimumab加nivolumab、pembrolizumab加axitinib和avelumab加axitinib。PD-L1表达在肾癌中的作用正在演变；目前，无论PD-L1表达如何，含有ICI的联合方案都被批准。在CHECKMATE214中，一项III期试验比较了nivolumab加ipilimumab和sunitinib对以前未经治疗的透明细胞肾癌患者的疗效，在肿瘤细胞PD-L1表达为≥1%（用28-8试验测量）的患者中观察到了较长的中位生存期，但在PD-L1表达<1%的患者中没有观察到双重ICI。相反，在接受双重ICIs治疗的中危或高危疾病患者中，在所有水平的肿瘤细胞PD-L1表达中，观察到比使用舒尼替尼的患者更长的OS和更高的ORR，尽管PD-L1表达为≥1%的人群受益程度更高。探索ICIs与VEGFR抑制剂联合应用的疗效的研究也表明，无论PD-L1表达如何，都是有益的。在PD-L1表达的肿瘤患者和不表达PD-L1的肿瘤患者（使用22C3试验）中，观察到pembrolizumab加axitinib与舒尼替尼相比，OS和PFS的改善幅度相似（使用22C3试验），在PD-L1+肿瘤患者（使用Ventana SP263试验定义为IC评分为≥1%）和整个研究人群中，均观察到Avelumab加Axitinib的PFS受益。因此，PD-L1不是FDA批准的肾癌患者ICIs或ICI方案的组成部分，因为对其临床价值的证据相互矛盾。
PD-L1是目前最有效的癌症免疫治疗预测性生物标记物，尽管它也不完美。对2011年至2019年FDA批准抗PD-1或抗PD-L1抗体的临床试验数据的回顾性分析表明，PD-L1仅在28.9%的患者中被用作预测性生物标志物。利用率低是由于多种因素所造成，包括瘤内异质性，动态宿主免疫，以及由于对治疗的适应性反应，基线检测可能不能反映快速诱导PD-L1表达的实际情况。因此，为了提高生物标记物-反应关系的关联度，已经探索了组合不止一个生物标记物和/或化验的模型。关于这类生物标记物的文献很多，我们在这里将重点放在与PD-L1表达一起被专门研究过的两个方面：肿瘤突变负荷（TMB）和TIL。
TMB已被作为预测多种实体肿瘤的生物标志物进行了研究，特别是在非小细胞肺癌（NSCLC）中。TMB没有标准的定义，尽管它通常包括每兆肿瘤基因组中的体细胞突变（错义、同义或非同义编码突变，和/或短INDELs）的数量。2020年6月，FDA批准使用pembrolizumab治疗TMB高的肿瘤患者，其定义为使用Foundation OneCDx平台检测到≥10个突变/Mb。肿瘤细胞PD-L1的表达与TMB的关系不是线性的。高表达PD-L1的肺癌患者和高TMB的肺癌患者只有一部分重叠。因此，当这两个指标联合使用时，存在协同预测与ICIs反应相关的可能性，这一可能性已经在对接受atezolizumab治疗的非小细胞肺癌患者数据的回顾性分析中得到证实。在CHECKMATE 026试验中，NSCLC患者在一线治疗中接受nivolumab或化疗，与那些肿瘤只有其中一种特征的患者相比，PD-L1高表达且TMB高的肿瘤患者有更高的应答率和PFS持续时间。相反，在CHECKMATE 227中，接受nivolumab加ipilimumab治疗且肿瘤PD-L1表达水平低（<1%）和TMB高（≥10突变/Mb）的非小细胞肺癌患者的OS持续时间比单独接受且PD-L1表达水平高或低水平的患者更长。这些发现来自对小部分患者数据的回顾性分析，因此缺乏交互作用的统计证据，因而需要前瞻性研究来验证。同样，回顾性研究也表明，TIL的存在可能有助于预测各种实体肿瘤患者对ICIs的临床反应，尽管与反应相关的特定TIL亚群的特性在不同组织学中有所不同。几个预测模型已经检测了PD-L1表达与TIL相结合的效果。根据PD-L1的表达和TIL的存在与否，提出了四种不同的肿瘤免疫微环境亚型：I型（PD-L1+且有TIL驱动适应性免疫抵抗），II型（PD-L1-且没有TIL，表示免疫忽视），III（PD-L1+且没有TIL，表明存在内源性诱导）和IV型（PD-L1-且有TIL，表明有其他抑制因子在促进免疫耐受）。I型肿瘤患者被认为是那些最有可能从单剂抗PD-1或抗PD-L1抗体中受益的患者，因为有证据表明，这些肿瘤内已经存在被PD-L1参与抑制的T细胞。PD-L1表达和TIL水平都较低的患者似乎从抗PD-1或抗PD-L1抗体中获益有限，可能需要使用其他能够辅助创造更有利免疫微环境的药物。因此，肿瘤细胞上PD-L1的表达反映了一种免疫激活的微环境，虽然与其他免疫抑制分子，包括PD-1和PD-L2相关，但仍然是与抗PD-1或抗PD-L1抗体反应最密切的单一因素。将建立肿瘤分层标准作为联合生物标记物的一部分将是一项具有挑战性的任务。然而，上述研究为考虑生物标记物各种组合的方法提供了一个起始框架。最终，使用多个生物标记物来指导患者选择的矩阵法，而不是目前的线性模型，可能会提供改善患者治疗结局的机会。验证这些生物标志物组合方法的前瞻性研究也是需要的。目前对PD-L1表达的评估主要是通过用福尔马林固定的组织样本获得的表达情况。然而，只有在部分患者中，这些样本是在治疗前获得的；通常，活检样本是在诊断时获得的。这种情况引起了人们对PD-L1作为生物标志物的可靠性的质疑，特别是当PD-L1表达的位置异质性以及PD-L1表达会随着肿瘤及其免疫微环境的演变而随时间动态变化，这些可能性进一步加剧了对准确性的担忧。最关键的是，考虑到干扰素和Toll样受体配体对PD-L1在肿瘤细胞和抗原提呈细胞上的诱导性，使用PD-L1作为ICIs合适的生物标志物需要考虑药效学变化。此外，放疗、化疗和靶向治疗都能诱导PD-L1的表达。显然PD-L1阴性肿瘤实际上可能反映了PD-L1表达的异质性和/或时间性变化，这些变化在样本采集时未被检测到或不存在。克服PD-L1在肿瘤组织中表达的生物异质性显然是困难的，尽管我们强调，被测试的肿瘤组织应该在时间上尽可能接近，并且在临床上与抗PD-1或抗PD-L1抗体的启用有关。各种新技术使得重复测量PD-L1成为可能，其方法比重复组织活检取样的侵入性更小。下一代测序技术，特别是在单细胞水平上，可能能够识别表达PD-L1的细胞，尽管转录组的方法不容易传达出空间信息，目前也还远远不能在实验和经济上获得这种数据。
测量CTC（循环肿瘤细胞）上PD-L1的表达水平可能是一个更可行的选择，尽管这种测试的预测价值以及与肿瘤细胞上PD-L1表达的一致性程度仍不清楚。此外，某些肿瘤类型产生的CTC数量较少，可能会限制这一方法的广泛应用。
由于蛋白质组学的进步，对循环和/或分泌或脱落形式的PD-L1蛋白水平的定量可能更具成本效益，而且能更容易连续执行。作为癌症登月（Cancer Moonshot）小组建议的一部分，癌症免疫监测和分析中心目前正在评估这一假设，方法是将PD-L1标准的临床实验室改进修正方案IHC作为一个综合性生物标记物与正交方法进行交叉比较，包括PD-L1的多重免疫荧光和免疫组化染色以分析肿瘤与免疫细胞的相互作用；RNA测序可获得转录本水平的信息；质谱（CyTOF）检测则基于细胞的蛋白表达；对可溶性或外泌体来源的PD-L1和其他可溶性因子的定量进行邻近延伸多重评估（proximity extension multiplex assessments）。假设循环PD-L1和PD-1水平可单独或组合以反映肿瘤和/或免疫细胞PD-L1的表达和/或ICIs的药效学效应。然而，任何基于可溶性蛋白检测的方法都必须面对这样一个警告，就是ICIs本身可能会通过稳定分子或掩盖对某些表位的检测来影响对可溶性标记的测量。确定这类可溶性生物标记物的来源需要独立于这些技术因素，这些生物标记物也具有功能。最终，发展在外周纵向定量PD-L1的方法还需要数年的时间，应该以临床实用性和被证明独立于影响PD-L1表达的调控机制为指导，或者至少将这些机制整合到一个包含有各种相关细胞相互作用和分子通路的多维度评分系统中。最后，多重免疫荧光作为一种诊断试验已经成功地进入了临床实践中。现有数据可支持对PD-L1与CD8和/或CD68的多重评估。然而，到目前为止，制药公司一直在犹豫是否将那些标准临床实验室难以评估的生物标记物纳入到关键临床试验中。考虑到目前使用IHC评估和报告PD-L1表达的复杂性，仔细和注释良好的报告变得极其重要的，以便用最不含糊的格式向临床医生呈现数据。每种肿瘤类型的PD-L1 IHC结果报告应包括关于检测方法的一般信息、对照部分的结果和患者标本的结果。具体的报告细节可能会根据不同的检测和肿瘤组织学而有所不同，尽管这些内容也应该包括所使用的检测方法，如抗体克隆、自动染色平台，以及它是商业检测还是LDT。重要的是，该报告应包括解释手册所建议的PD-L1 IHC在恶性肿瘤和/或免疫细胞中的表达，以及监管机构批准的单项检测的阳性阈值（用于伴发诊断）或临床试验结果建议的阳性阈值（用于补充诊断）。用于治疗多种实体肿瘤患者的ICIs的开发仍在继续，尽管随着我们开发更复杂的治疗模式，特别是联合疗法，用于识别最有可能受益的患者的最佳手段将变得更加复杂。尽管复杂，IHC测定的PD-L1表达目前仍然是预测ICIs治疗后反应和治疗结局最成熟和最有效的生物标志物。与其他候选生物标记物的分析方法相比，PD-L1 IHC分析方法操作相对简单，系统实施简单，其分析和临床性能也已为人们所熟知。晚期NSCLC一直是开发PD-L1 IHC作为ICIs预测性生物标志物的标杆。然而，即使在这种情况下，PD-L1的预测作用也变得不那么明显，因为如上所述，ICIs和化疗的组合已经发生了演变。PD-L1的高水平表达显然与接受ICI单一疗法的患者的预后改善有关，而当与化疗组合或添加第二种ICI（如ipilimumab）时，这种关系变得不那么清楚。许多完善评估和使用这一复杂生物标志物的机会仍然存在。临床试验中使用的PD-L1评分分界点旨在实现统计上预先定义的结果，并不能反映全部的生物学状态，这部分可以解释PD-L1相对于用于指导靶向治疗的分子生物标记物（如非小细胞肺癌患者的EGFR改变）而言不太准确的阳性和阴性预测值。此外，诊断化验的监管环境也极其复杂，在特定的临床环境中，个别化验被批准为伴随诊断。研究人员和临床医生必须很好地理解在同一临床队列中使用一种检测方法与另一种检测方法的临床意义，包括单个病理实验室中使用LDT，因为在不能使用多种检测方法来测试从单个患者身上所获得的有限组织样本。随着病理实验室的数字化病理和图像分析的实施，可能采用IHC后对PD-L1的自动定量。然而，这一实施将需要图像分析算法的严格验证和病理学家的持续质量控制。尽管存在这些挑战，但我们相信，通过开发新的方法来评估PD-L1随时间的表达变化，并将PD-L1纳入可更好地反映免疫微环境和其他肿瘤相关和宿主相关因素的多部分模型，还有机会将PD-L1发展为有用、可靠的预测性生物标记物。最后，作为一个医学共同体，我们必须努力简化监管环境，使PD-L1检测能够以系统的方式进行，以便更可靠地指导患者的诊疗和护理。
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