流式实验中的坑，我都帮你踩过了-第三坑
病例介绍
Annexin V和PI双染法研究细胞凋亡是经典的流式实验之一，磷脂酰丝氨酸（phosphotidylserine, PS）在正常细胞中存在细胞膜内侧，在细胞凋亡早期磷脂酰丝氨酸从细胞膜内侧外翻到细胞膜表面，与Annexin V-FITC结合。而PI是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在细胞凋亡发生中晚期，由于细胞膜通透性增加，PI透过细胞膜从而标记细胞核DNA。因此Annexin V和PI联合使用，可同时用来鉴定活细胞、凋亡早期细胞、凋亡晚期细胞以及核碎片，原理如图一。
图1 细胞凋亡检测
然而在实际进行细胞凋亡（Annexin V-FITC/PI）检测时，我们尴尬的发下自己尝试的结果最后呈现的与经典流式图背道而此的状态，活细胞、早期凋亡和晚期凋亡不知所踪，反而只剩下一团细胞群缩在流式图角落里，如图二分析。
图2 细胞凋亡检测失败案例
小贝问诊答疑
那为什么会出现这种状况了？我们猜测可能原因：
细胞没有凋亡，或者凋亡很少。
但似乎这又是立不住脚的假设，正常细胞都有一定比例的凋亡细胞，而且实验中按照上图分析，实验用药组和对照组结果一致，这和我们使用其他方法观察的现象相悖。
染色失败，试剂失效。
在该实验中，Annexin V与PS结合是Ca2+依赖性的，由于实验中错误的添加金属螯合剂,如EDTA等，或者出现Ca2+盐溶液，PI试剂失效等问题，影响最后结果呈现。当然，我们也更换了新的试剂盒检测，依然是这样效果，貌似也说不通。
细胞丢失了。
原本检测的细胞由于在离心和弃掉上清的过程中，由于操作不当的物理因素，把细胞倾倒出去，或者细胞变成了碎片。但是我们在流式管底可见明显细胞团块，镜检也能看到正常细胞，这个原因也不再考虑范畴。
当我们排除以上各种因素，我们需要考虑我们是不是在数据分析过程中出现了问题，没有找到真正的目的细胞群体。在CytoFLEX上每个通道都有7个对数域，他的检测范围会远远大于传统的流式细胞仪范围，在分析结果时我们习惯呈现部分检测视野，细胞群体仍然处于较高位置，最后造成误判，就需要调节坐标轴（显示）的范围。对于这种情况，我们进入“图属性”界面，修改X轴和Y轴的坐标轴范围，以保证所有细胞群体进入显示范围内，如图三当我们重新修改了X轴和Y轴范围，我们发现画门分析的群体只是碎片信号，真正的细胞信号（红色箭头标识）被我们忽略了。
图3 修改坐标轴的流式结果图
小贝处方
当我们找到细胞用于后续分析时，统计凋亡细胞比例发现凋亡细胞在实验组和对照组没有变化，甚至流式细胞术检测的凋亡发生率情况和我们利用其他方法观察到的结果相悖，这又会是什么原因了？
如果从流式数据分析流程上寻找原因，我们第一步同样需要检查是否正确找到目的细胞。细胞凋亡时，形态发生了变化，其散射光也随之发生变化。凋亡早期，细胞固缩，形态变小，反应在前向散射光参数就是FSC变小。紧接着，细胞的粒度增加，细胞反射性及细胞内部结构变得复杂，反应在侧向散射光参数就是SSC增加。凋亡晚期，形成凋亡小体，大小和粒度都变小了，反应为FSC和SSC都减小了，直至细胞死亡。
在分析流式结果时，我们除了要准确圈定细胞信号，还要圈定目的细胞信号，因为凋亡的发生，FSC-SSC散点图上细胞信号会变成两个单独群体，有时候我们会习惯圈定其中一群主要细胞群体，而凋亡发生的细胞主要存在FSC变小的群体之中（红色箭头标识），所以在分析时我们需要将两群细胞一同圈门分析，如图四。
图4 凋亡分析
我们以凋亡细胞分析为例，简单和大家探讨了寻找目的细胞的过程。在分析过程中，寻找正确的目的细胞是很重要的分析步骤，直接影响到后续流式结果解读。
思维发散区
当我们分析细胞凋亡时，FSC大的和FSC小的细胞群两群细胞作为目的细胞进行分析，但当我们进行细胞免疫分型，在FSC-SSC图中目的细胞应该选择哪一群细胞？
A：FSC大的细胞群
B：FSC小的细胞群
C：两群细胞
大家可以根据自己所学流式知识思考一下，欢迎大家填表问答，我们将送出“解压神器“，答案下期公布。