SOP文件||实验室预防“假阳性”检测结果的操作规程

实验室SOP文件

一、目的

规范实验室操作，了解可能导致实验室产生“假阳性”检测结果的来源，建立防范措施，保证实验室检测结果的准确性。

二、适应范围

临床基因扩增检验实验室。

三、责任人

临床基因扩增检验实验室工作人员。

四、内容

1. 可能导致实验室产生“假阳性”检测结果的来源

1.1 样本间的交叉污染

1.1.1 样本管开盖（尤其是离心、震荡混匀后的开盖）时，易产生气溶胶，污染操作区域（生物安全柜）。样本管时易污染手套，通过手套再污染其他样本。

1.1.2 吸样/加样过程中，尤其移液枪吸样过急、过快、反复吸样、枪头无滤芯或过短等，均易导致移液枪下端甚至移液枪腔体内污染。

1.1.3 全自动核酸提取仪在提取程序下进行磁珠洗涤（由于加温、 多次上下或水平震荡洗涤）时，易形成气溶胶。

1.1.4 加模板时，由于操作不当、有气泡时或者枪头过短等，可能会污染邻近孔或移液枪污染。

 1.2 实验室“遗留扩增产物”的污染

1.2.1 PCR扩增时由于管内液体“蒸发”导致的气溶胶污染：常见有PCR反应管未盖紧或PCR反应板的膜未封紧、反应管与管帽的匹配性不佳在高温变性中造成气溶胶污染，等。

1.2.2 PCR扩增后反应管处理不当导致气溶污染：如反应结束后扩增反应管未及时清除， 误操作打开盖子；或者，PCR管在实验区域内高压消毒，导致扩增产物污染，等。

1.3 其他可能的污染来源

1.3.1 试剂污染导致的“假阳性”。

1.3.2 某种偶然误差如加错样本所致的“假阳性”。

“假阳性”扩增曲线

2.  防范实验室产生“假阳性”检测结果的措施

 2.1 保持通风：这是极其重要的预防前述“污染”的措施！

 2.2 规范的实验室分区设置：

2.2.1 实验室建设遵循：《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》卫办医政发【2010】194号及《医疗机构临床基因扩增检验实室工作导则》、《实验室生物安全通用要求GB19489-2008、《病原微生物实验室生物安全通用准则》WS233-2017，等。

2.2.2 实验室各区的使用管理：所有消耗品使用前均应保存在洁净区域（如试剂准备区或库房，不能放在标本制备区和扩增区）；单一工作流向，等。

 2.3 规范的实验室内技术操作：相关的SOP文件。

2.3.1 实验操作中的细节：

◆ 加样器加样时，必须使用带滤芯吸头；

◆ 加样过程中出现加样器头部污染时，则立即采用加样器清洁流程进行清洁。

◆ 检测过程中，如发现手套污染即丢弃换新的手套；

2.3.2 清洁消毒中的细节：

◆ 加样器用后，用10%次氯酸钠擦拭表面，尤其是与吸头接触部位，然后再用70%乙醇擦拭；

◆ 每一批检测后，有阳性尤其是较多阳性检出

时，可用70%/75%乙醇对标本制备区空中喷雾（注意防爆燃），然后用10%次氯酸钠（体积比）溶液，擦实验室台面和地面等（注：各区清洁用具须专用）；

◆ 所有试管架每次用后，用10%次氯酸钠溶液擦拭或喷雾清洁；

◆ 每批检测后，按SOP清洁仪器设备（提取仪、离心机、扩增仪等）；

◆ 每批检测后，室内紫外照射2小时，可使用可移动紫外灯；

2.4 严格的质量控制：包括阳性、阴性质控和环境污染评估，等。

◆ 质控品应与所有标本同时检测。至少一个弱阳性质控和三个阴性质控样本随机放在临床标本中间，参与从提取到扩增检测全过程。

◆ 及时观察样本检测整体情况，如果出现阳性结果偏多，尤其是出现较多单靶阳性或弱阳性结果则很可能有污染的存在。

2.5 严格的复检流程：通过对阳性结果的复检来避免。（选另一家试剂或采用其它方法学，由于它的引物和探针结合区域与前种试剂不同，因此可以鉴别出前种试剂扩增产物引起的假阳性。）

◆ 实验室应常备两种以上不同厂家的核酸检测试剂。一种用于日常检测（初检），另外一种或两种（与日常检测试剂的扩增靶区域不同，且分析敏感性或称检测下限要好于初检试剂）用于出现阳性结果的标本的复核检测（复检）；只有复检同样为阳性时，才能报出。

◆ 在人群筛查时，一旦出现弱阳性或单靶阳性，尤其是前一次出现过阳性检出时，很可能是污染所致。

原因1.因为在潜伏期末期及发病初期患者咽部拭子绝大部分（95%以上）均为强阳性；

原因2.由于目前的试剂盒多为双靶或三靶，但对不同靶基因的检测效率有差异，且有的差异还较大，从而扩增效率高的单靶更容易出现污染，因此如果出现扩增效率高的靶基因单阳性，很可能为污染所致；

原因3.某次检测不明原因出现较多阳性，且多为较弱或单靶阳性。