宏基因组专题 | 宏基因组分析流程，基于reads VS 基于组装?
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所谓宏基因组学 (或元基因组学, metagenomics) 就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象, 以功能基因筛选和/或测序分析为研究手段, 以微生物多样性、 种群结构、 进化关系、 功能活性、 相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的微生物研究方法。随着测序技术的不断发展，宏基因组研究也越来越多。然而，在分析流程上，基于reads还是基于组装，两者有何缺点和优点？很多研究者难以抉择。本文以此为题，详细为大家讲解。
宏基因组基于reads和基于组装的分析流程比较
1.基于reads的宏基因组分析流程
1.1 分析流程主要步骤（如图1）：
(1) 数据质控：测序得到的原始数据会存在一定比例的低质量数据，为了保证后续信息分析结果的准确可靠，首先要对原始数据进行质控及宿主过滤，得到有效数据。分析中将使用Cutadapt彻底清除原始数据中的Illumina接头序列，再用PrinSEQ去除低质量的序列片段和个别序列。质控前和质控后，会用FastQC来检测质控的合理性和效果。
(2) 去除宿主：质控处理后的数据通过bowtie2比对到宿主的基因组，没有比对到的序列被保留下来做后续分析。
(3) 物种注释：使用Kraken2和自建的微生物数据库[合并从Kraken官网下载各个微生物数据库(细菌，真菌，古菌，病毒)]来鉴别样本中所含有的物种，再用Bracken来对样本中物种的实际相对丰度进行预测。相较于基于组装的物种注释，基于序列的宏基因组物种注释方法更加全面和准确。
(4) 常用功能数据库注释：从质控以及去除宿主基因的reads出发，使用HUMAnN2软件（基于DIAMOND），将各个样本的reads比对到数据库（UniRef90），根据UniRef90 ID 和各个数据库的对应关系，得到各个功能数据库的注释信息和相对丰度表。
(5) 基于物种丰度表和功能丰度表，可以进行丰度聚类分析，PCoA和NMDS降维分析（仅物种），样品聚类分析；当有分组信息时，可以进行LEfSe biomarker挖掘分析以及代谢通路比较分析，挖掘样品之间的物种组成和功能组成差异。
(6) 抗性基因注释：从去除宿主基因的clean reads出发，使用FMAP软件将各个样本的质控以及去除宿主基因的reads与抗生素抗性基因数据库CARD进行比对注释，可以获得抗性基因丰度分布情况。
1.2 优缺点
优点：
(1) 分析软件（humann2）由世界顶尖团队研发，文章发表在Nature，引用量数千，是目前前沿的权威的宏基因组分析软件。
(2) 能够用比较科学的方法鉴定功能的物种来源，既能研究功能组成，也能研究每个功能都是来自哪些物种。
(3) 分析速度稍快。
缺点：
分析基于已有数据库，没法检测样品中的新基因（不存在于数据库中的基因）。但实际上在宏基因组的研究中，新基因的鉴定争议很大，宏基因组中的新基因的研究价值并不大。
2.基于组装的宏基因组分析流程
2.1 分析流程主要步骤
(1) 数据质控：测序得到的原始数据会存在一定比例的低质量数据，为了保证后续信息分析结果的准确可靠，首先要对原始数据进行质控及宿主过滤，得到有效数据。分析中将使用Cutadapt彻底清除原始数据中的Illumina接头序列，再用PrinSEQ去除低质量的序列片段和个别序列。质控前和质控后，会用FastQC来检测质控的合理性和效果。
(2) 去除宿主：质控处理后的数据通过bowtie2比对到宿主的基因组，没有比对到的序列被保留下来做后续分析。
(3) 物种注释：使用Kraken2和自建的微生物数据库[合并从Kraken官网下载各个微生物数据库(细菌，真菌，古菌，病毒)]来鉴别样本中所含有的物种，再用Bracken来对样本中物种的实际相对丰度进行预测。相较于基于组装的物种注释，基于序列的宏基因组物种注释方法更加全面和准确。
(4) 组装：运用megahit软件，将所有样本去宿主基因后的clean reads进行组装（megahit默认组装参数），得到contigs;
(5) 基因预测：运用prodigal软件，预测contigs中的基因序列;
(6) 基因去冗余：用cd-hit软件，对得到的基因进行去冗余，得到去冗余基因;
(7) 基因定量：使用salmon软件，对去冗余基因进行定量;
(8) 常规功能注释：使用eggnog-mapper, diamond软件，对去冗余基因进行各个数据库的注释。统计各个数据库的基因相对丰度表。
(9) 抗性基因注释：运用diamond软件，将去冗余基因比对到CARD数据库，得到CARD数据库的抗性基因注释信息，根据去冗余基因的丰度信息，统计抗性基因的相对丰度表。
2.2 优缺点
优点：
可以预测所有基因，包括数据库中没有的基因，但这部分基因的功能是未知的。一般来说，目前的数据库已经非常全面了，如果一个基因和数据库没比对上，它也可能是由测序，软件分析的误差造成的。
缺点：
(1) 没有成熟的分析软件，没有标准的分析过程。
(2) 目前没有成熟的软件来鉴定基因的物种来源。
(3) 分析速度稍慢。
3.常见误区
部分科研人员觉得组装得到的contigs比reads长，所以基于组装的流程在功能分析时会更加准确。如果您研究的是单个基因功能，不需要知道丰度信息，那这种说法没错。就宏基因组来说，要对功能（基因）进行定量，无论是基于reads还是基于组装，都需要把reads和基因进行比对，只不过基于reads分析，是把reads和数据库中的基因进行比对定量，而基于组装，是把reads和样本中预测得到的基因进行比对定量。所以就准确性来说，两者并没有太大区别，甚至可以说，成熟的humann2的结果更加值得信任。基于组装的流程，为了得到基因丰度，需要比对两次，第一次是reads和预测基因比对，第二次是预测基因和数据库基因比对，比基于reads的分析流程多了一步，实际上增加了犯错误的概率。
4.如何选择
如果您的目的是发现宏基因组中的新基因，研究新基因的功能，丰富已有数据库，那可以选择基于组装的分析流程。如果您想基于已有数据库，研究样本中的功能，以及功能的物种来源，应该选择基于reads的分析流程。基于组装的分析流程在过去比较流行，因为那时数据库还不太全面。就目前来说，我们建议优先选择基于reads的分析流程，除非您的样品来自于一个极端的环境条件，无法在数据库中找到基因功能，而您想为数据库贡献一些基因序列。
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