Western bloting 实验流程 （2014-07临床医学研究中心）

Western blotting实验流程

实验流程共分为6步：

1 待测蛋白的准备；

2 蛋白电泳；

3 转膜；

4 抗体结合；

5 曝光；

6 灰度值统计分析。

一、待测蛋白的准备

1. 细胞蛋白的提取：

（1）拿出六孔培养板，去培养液，PBS洗细胞两遍，根据细胞密度每孔加50~100µl细胞裂解液（含1%的蛋白酶抑制剂PMSF,现用现配），冰上或冰箱-20℃放置10~20分钟裂解。

（2）将培养板置于冰上，用细胞刮挂下细胞，每孔刮一分钟左右（刮不同孔细胞需用PBS或水冲洗细胞刮，洗后甩干），收集裂解液于1.5ml EP管中，置于冰上裂解10~20分钟，期间需用振荡器振荡混匀3次，每次15秒左右。

（3）12000rpm，4℃冷冻离心5min左右，收集上清置于新EP管，存于-80℃。

2. BCA法蛋白溶液浓度测定（具体步骤按试剂盒说明书）

（1）配制BCA工作液：打开37℃恒温箱预热加温，取出BCA标准品与蛋白样品解冻，配BCA工作液，A：B=50：1， A液总量=（8个标准蛋白+待测蛋白数量）*200µl，B液总量=（8个标准蛋白+待测蛋白数量）*4µl，配好后混匀。

（2）配制BCA标准品与标准曲线：用PBS稀释好标准品，按说明书将标准品加入到96孔板中，再补加PBS到一样体积。

（3）配制蛋白样品：取出蛋白样品，解冻后振荡混匀，每孔加入5µl蛋白原液，补加PBS稀释（稀释可节省蛋白，记住稀释倍数，蛋白较多时也可不稀释直接加蛋白原液测；蛋白孔可做2~3个平行孔，测量时取平均值较准）

（4）加入BCA工作液：每孔各加200µl已配好的工作液（可用排枪），盖上板盖混匀30秒（可用酶标仪振荡），37℃孵育30min，放好蛋白样品。

（5）测蛋白浓度：打开酶标仪预热10分钟以上，孵育完后取出96孔板冷却到室温，用移液枪去除小气泡，用纸巾擦干96孔板板底水珠，调节酶标仪波长，放入打印纸，打开96孔板板盖，在570nm波长下读取数值，空白孔可设可不设。（具体按酶标仪操作说明，可以测几次选取）

（6）计算浓度：用EXCELL表格制作标准直线方程，计算待测蛋白浓度（若稀释测量的记住要乘以稀释倍数才是最终蛋白浓度），然后以每个条带最低浓度那组蛋白为标准计算各组蛋白上样体积与细胞裂解液RIPA的补加体积。（注意：标准曲线R平方值在0.99以上才可用，每孔蛋白上样量要8微克以上才行。）

（注意：用移液枪加液体时可沿96孔板的孔壁加，避免产生气泡影响结果）

二、蛋白电泳

一共分为5步：

1 试剂配制；

2 配胶；

3 蛋白处理

4 加样；

5 跑电泳。

1. 试剂配制

⑴10%SDS：  SDS粉剂       10g

蒸馏水        100ml                      室温过低，容易出现絮状沉积，需加热摇匀

⑵30%丙烯酰胺：  丙烯酰胺                   14.5g                     避光磁珠搅拌溶解，

N,N’-亚甲基甲叉双丙烯酰胺                  0.5g                      盛于棕色瓶中，4℃保

蒸馏水                                     50ml                     存，一个月有效期

⑶10%过硫酸铵：  过硫酸铵      0.1g

蒸馏水                       1 ml     置于EP管摇匀，4℃避光保存，3日有效期，现用现配最好

⑷5×电泳缓冲液：  Tris碱      15.1g

甘氨酸       94g

10%SDS          5g    磁珠搅拌混匀，常温放置。使用时用

蒸馏水    1000ml       蒸馏水稀释至1X

⑸其它：1.5M Tris（PH8.8）、1M Tris（PH6.8）均用试剂公司产品，常温放置

2. 配胶

⑴检漏：洗干净玻璃板（不可用刷子刷），上面放好制胶架；板槽放好长条海绵胶；用板夹加紧两块玻璃板（注意两块玻璃板的正反面及左右、底部是否对其，上下是否颠倒，否则容易漏胶）；将板夹固定在板架上（特别注意：要将玻璃板底部在长条海绵胶上用力压一压，使其紧贴海绵胶，否则极易漏胶）；组装好后用枪灌满水检漏，待一段时间后不漏水即可将水倒出并用纸或布吸干边角处

⑵配置12%分离胶：（例如：按下述方法配制10ml量，可灌两块胶（BIORAD），做大分子蛋白时可配10%等低浓度胶,10%过硫酸铵与TEMED是凝胶试剂，应最后加，加完后立刻灌胶）

蒸馏水            3.3ml

30%丙烯酰胺        4ml

1.5MTris                2.5ml           用5L移液枪充分混匀

10%SDS           100µl

10%过硫酸铵       100µl

TEMED             4µl

⑶灌分离胶：用5L移液枪将配置好的分离胶混匀，接着沿玻璃板壁边缘，加入两块玻璃板夹层中，液面大约致玻璃板的3/4处（约3.8ml），两块胶最好一致，再用无水乙醇加满至玻璃板上缘来压胶。

⑷凝胶：等待约30~60分钟，出现明显的分界线，代表分离胶已经完全凝固。将整个玻璃板架抬起，倾倒上层的乙醇，灌入蒸馏水冲洗一次，倾斜胶架倒出水后用纸或布吸干边角处，放平玻璃板架。（凝胶时间与温度相关，冬天时间稍长，最长约60分钟；夏天时间稍短，最短30分钟亦可）

⑸配制浓缩胶：（按下述方法配制6ml量）

蒸馏水            4.1ml

30%丙烯酰胺      1.0ml

1.0 MTris              0.75ml          用5L移液枪充分混匀

10%SDS            60µl

10%过硫酸铵        60µl

TEMED             6µl

⑹灌浓缩胶：将齿梳洗干净并擦干，用5L移液枪将配置好的浓缩胶混匀，接着沿玻璃板壁边缘，加入两块玻璃板的夹层中，添加在分离胶上，加满至玻璃板上缘，注意避免灌入气泡。然后将齿梳插入，观察孔底是否有气泡，有气泡应拔出重灌。（注意：由于浓缩胶凝固较快，因此，混匀时间不宜太长，要尽快加入玻璃板内）

⑺凝胶：等待约30~60分钟，齿梳边缘出现浓缩胶的界限，代表浓缩胶已经完全凝固。.凝胶时间亦和环境温度有关（具体见上）。（注意：低温保存的配胶试剂用完后应及时放回冰箱保存，10%过硫酸铵最好现用现配，胶也可4度过夜保存）

3. 上样蛋白处理及保存

⑴解冻：取5×的蛋白上样缓冲液与细胞裂解液RIPA。（需要放于-20℃冰箱中保存，使用前解冻揺匀）

⑵配平蛋白浓度：从-80℃冰箱中取出蛋白上清液，室温解冻后振荡混匀。按测好的蛋白数据从各组蛋白中取出相同蛋白量（至少8微克以上）的蛋白上清液，按蛋白数据以最低浓度组蛋白为标准向各组高浓度蛋白加入相应的细胞裂解液RIPA，配平至一致浓度，然后按4:1加入5×的蛋白上样缓冲液（占1/5），用混匀器充分混匀,混匀后轻度离心到管底（举例：取20µ的蛋白上清液，加入5µ的5×的蛋白上样缓冲液）。

⑶蛋白变性：将上述液体放入90℃以上沸水中，煮5min，使蛋白变性。（煮蛋白时，需要将装有蛋白液体的离心管，放入凿好合适孔径的水上漂浮载体上，再放入盛好水的电磁炉中，使离心管底部的蛋白液体受热变性，同时又保持管口朝上不会进水，导致浓度改变；煮的过程，离心管盖容易被胀开，可打开电磁炉锅盖，温度调到120℃来有效避免）

⑷离心：将煮好的蛋白液体常温冷却后，轻度离心到管底（如2000rpm，30s）。若暂时不用可放入-20℃冰箱中保存待用。

4. 加样

⑴加电泳液：卸掉玻璃板夹，取出玻璃板。将玻璃板放入电泳架上（注意：将玻璃板放进电泳架时，一定要向下压紧，使其底面贴紧，再上好压扣，否则容易漏液，注意小玻璃板朝内，大玻璃板朝外）。将上好玻璃板的电泳架放入电泳槽中，红对红，黑对黑，电泳架内倒满新配置的1X电泳缓冲液，电泳架外（即电泳槽内）倒入回收的或新的电泳缓冲液，一般液面至玻璃板的一半高度即可（电泳槽外有刻度，2块胶一半高度左右，4块胶加满）。

⑵上样：从-20℃冰箱中，取出配置好的蛋白样品液体和MARK样品，拔掉齿梳，将点样架放在电泳架上。用10µl的移液枪，混匀后按以下顺序加样，例如：

MARK	1	2	3	4	5	6	7	8	MARK
6µl	18µl	18µl	18µl	18µl	18µl	18µl	18µl	18µl	3µl

5. 跑电泳

⑴拿掉点样架，盖上电泳槽盖（注意：红对红，黑对黑）。将盖上的插头，插入电泳仪中（注意：红对红，黑对黑）。

⑵先用恒压80V，待样品跑至分离胶，即MARK开始分离出多条带（时间大约20min），再转成恒压120V。（注意：样品在浓缩胶内会慢慢由宽带压缩成窄带，MARK应该会压缩成一条细线。）

⑶转成恒压120V后，待样品跑至分离胶底部后（时间大约60min），即可停止电泳。（注意：若要再分离大分子蛋白可继续往下跑，每孔的样品应该在各自的泳道，互不相扰。样品底部应该有一条红色线状条带）

三、转膜

一共分为4步：

1  试剂配置

2  “三明治”夹层

3  转膜

4  染色

1. 试剂配置及转膜准备

（1）1X转膜缓冲液：Tris碱       5.8g

甘氨酸      2.9g

SDS        0.37g   充分磁珠混匀后，4℃下冷却1小时以上

甲醇      200ml   (未加甲醇可室温保存，加入甲醇后需4℃

蒸馏水     800ml    保存，可用2到3次）

（2）剪切PVDF膜：用剪刀，剪切PVDF膜，大于滤纸和胶。用甲醇浸泡10秒钟以上（活化PVDF膜）。

（3）剪切滤纸：用剪刀，剪切滤纸，大于胶。

（4）冰浴箱：用泡沫箱装入水、冰和冰袋。为保证低温，需提前做好。

（5）3‰TBS-T：  TBS       1000ml

Tween20        3000µl     磁珠搅拌混匀，PH调到7.5左右

（6）10×丽春红S染色液：丽春红S  2g

磺基水杨酸   30g   磁珠搅拌混匀（也可从试剂公司购买现成

三氯乙酸    30g   的）

​（7）考马斯亮蓝G250染色液：G250 0.25g

甲酸  50ml          （100ml，甲酸：乙酸：水          为5：1：4，

乙酸 10ml              磁珠搅拌混匀）

蒸馏水40ml

2. “三明治”夹层

⑴将分离胶、PVDF膜、滤纸，和转膜架、绝缘胶布浸入转膜缓冲液中，10分钟。

⑵按下列顺序做好“三明治”：

负极                                             正极

（黑）              膜  膜           （白）

正  反

面  面

海绵垫  滤纸   胶     膜    滤纸  海绵垫

大小顺序为：膜＞滤纸＞胶。（厚滤纸每边各2层即可，薄滤纸每边各3层）

（具体方法：将转膜夹打开使黑的一面保持水平，泡在转膜缓冲液中，在上面垫一张海绵垫，在垫子上垫两层滤纸，铲胶时用胶铲撬开小玻璃板，将浓缩胶轻轻刮去，用水冲一下胶铲，把分离胶的四边先起一下。然后小心剥下分离胶盖于滤纸上，要避免把分离胶铲破，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用胶铲擀去气泡。接着将膜盖于胶上，要盖满整个胶，膜需剪好切角或用圆珠笔来标记正面，并除气泡，在膜上盖2张滤纸并除去气泡，最后盖上另一张海绵垫，合上转膜夹。）

3. 转膜

⑴将做好的“三明治”，放入转膜槽内（黑对黑），加入预冷的转膜缓冲液；并将转膜槽放入冰浴箱中。盖上转膜槽的盖子（红对红，黑对黑），将盖子的电极插入电泳仪（红对红，黑对黑）。

⑵冰浴下，用恒压100V，转膜90min。（注意：根据目的蛋白分子量大小来设定转膜时间，蛋白分子量越大，转膜时间越长，如：蛋白分子量60以下转膜90分钟，60以上转膜120分钟，200以上转膜180分钟，使用0.22μm孔径PVDF膜不会转过去，时间越长越好）

⑶转膜结束后，将膜夹出，放入TBS-T中。

4.染色（转膜条件稳定后可省略）

  方法：转膜结束后，将膜放入10×丽春红染色液中，摇床摇10分钟染色。将胶置于考马斯亮蓝染色液中，染色20分钟以上。膜染色完后，回收丽春红，用水或TBS-T轻轻冲洗膜上的染液，观察膜上是否有转上蛋白条带。胶染色完后，回收考马斯亮蓝染色液，用考马斯亮蓝脱色液或水来脱色，胶脱色得较透明时可观察胶上是否会残留有未转上的蛋白条带。（注意：丽春红染色灵敏度低，但可逆，考马斯亮蓝染色灵敏度高，但不可逆。若转膜不充分时可不必往下做。）

四、抗体结合

一共分3步：

1  试剂配制

2  蛋白封闭

3  一抗及二抗孵育

1. 试剂配制

⑴5%封闭液：     封闭脱脂奶粉  5g

TBS-T        100ml     充分混匀后，4℃保存

（牛奶易变质，3天有效期，最好现用现配）

⑵3‰TBS-T：       TBS      1000ml

Tween20     3000µl      磁珠搅拌混匀，PH调到7.5左右

⑶一抗封闭液：  一抗稀释液

一抗                    移液枪充分混匀，配成（1:300~500）

⑷内参封闭液：   一抗稀释液

内参                   移液枪充分混匀，配成（1:300~500）

⑸二抗封闭液：   5%封闭液

二抗（博士德）            移液枪充分混匀，配成（1:4000~6000），按说明书为准

2. 蛋白封闭

⑴转膜后，将膜放入TBS-T中，用摇床揺洗2~3次，每次5分钟。

⑵将膜放入培养皿中，加入5%封闭液，摇床上慢摇封闭1到2小时。

3. 一抗、内参及二抗孵育

⑴标记：将膜取出后放入TBS-T中去除封闭液，膜正面朝上，按照MARK标记用刀或剪刀切开目的条带和内参条带，并在条带左上角剪好切角，用圆珠笔标上抗体名称。

⑵封袋：将目的条带和内参条带分别用密实袋装好，用镊子夹住膜的边使膜的边贴紧小袋子的边，可以节省一抗的用量，用封口机封好3边，分别加入一抗封闭液和内参封闭液（每个约2ml左右），排清液体里面的气泡，再用封口机封好开口处，注意可封压几次以防漏液。

⑶孵育：将封好口的密实袋放于4℃冰箱的摇床中过夜。第二天放入摇床上室温慢摇复温1到2小时。

⑷回收一抗与洗膜：复温后再将密实袋剪开一角，挤出一抗来回收（一抗可回收使用5到10次，一个月左右有效期），用镊子将膜夹出，放入TBS-T中，不同条带可一起放，用摇床揺洗4~5次，每次5分钟。

⑸二抗孵育：将目的条带和内参条带分别放入孵育盒中，加入二抗封闭液（每个约3ml。将培养皿置于摇床上室温慢摇1小时左右，孵育完后二抗可回收使用1到2次（三日内，因牛奶易变质，现用现配最好，若用二抗稀释液则不易变质）。

⑹洗膜：将膜夹出，放入TBS-T中，不同条带可一起放，用摇床快揺5~6次，快摇可有效去除背景，每次5分钟，最后加TBS浸泡即可。

五、曝光（全暗房内操作）

一共分为2步：

1  显色

2  胶片曝光

1. 显色

⑴准备好实验用品，发光剂要置于冰盒内，胶片要避光放置，进入暗房后锁好门，关上门帘，打开洗片机预热，关灯看是否漏光。

⑵用纸巾擦干净暗盒胶膜内部，把膜置于干净培养皿中，正面朝上，关灯用剪刀剪取合适大小的胶片，一张可对半剪开用，置于抽屉中。

⑶开红灯，用1L移液枪，按说明书加入ECL试剂， A液： B液=1:1，各加600ul左右到培养皿中，将发光液混匀后均匀涂在膜的正面上，反应1分钟后关灯观察发光情况（若发光情况不好可继续涂发光液反应）。

⑷开红灯并将膜放入暗盒的胶膜中，膜可以靠左上方放置，盖上胶膜，排清气泡，再盖上暗盒压一下。

2. 胶片曝光

⑴关灯打开暗盒，取出胶片放置暗盒内左上方曝光，并根据光线强度，选择曝光时间。（光线越强，时间越短；光线越弱，时间越长，时间范围为1秒~30分钟，例如：光很强（1~5秒），光不强（30秒~2分钟），光偏弱（3~5分钟），无光（10~30分钟，25分钟以上效果较好））

⑵打开暗盒将曝好光的胶片取出，折右下角作为正面标记。打开洗片机盖子，将胶片打横靠左边放入，盖上机盖。

⑶待洗片机响了“滴”的一声后表示胶片已进入机内，此时可以开红灯，等胶片洗出来后，观察曝光情况，曝光情况不好可调整曝光时间继续压片。

⑷曝光结束后，开灯打开暗盒，将胶片对齐暗盒左上方，用记号笔在胶片上记录日期，抗体名称，条带附近MARK分子量和泳道号等。

⑸用保鲜膜把膜包起来放入4℃冰箱中保存，以后可重复使用，胶片用扫描仪扫成300DPI以上的TIF格式即可进行灰度值统计分析，最后要保存好胶片。

（技巧：曝光时若膜发光淬灭或背景发光过强可以把膜放入TBS-T中泡洗一会，重新配置发光液进行显色曝光；背景发光强也可用2张胶片重叠一起压片，曝光时间延长一点，取上层胶片，因下层的胶片可有效减弱背景；发光偏弱时可以将配好的发光剂均匀加入暗盒中的条带处，然后压片，这样可以增强发光。）

六、灰度值统计分析

⑴Quantity One（常用）

⑵Image J

⑶BandScan