CO-IP结果解读
蛋白参与的交互作用,都会用到一个共同的实验原理,叫免疫共沉淀(Immunoprecipitation),即用一个蛋白的特异性抗体去沉淀这个蛋白,与它存在结合的其他分子会被一起沉淀下来,接下来对沉淀物里的其他分子进行鉴定,核酸就用测序,蛋白就用质谱,就能分析得到与特定蛋白存在交互的其他分子。
理解了co-IP,ChIP和RIP是类似的原理,只是沉淀下来的物质一个是DNA,另一个是RNA。
如果A和B两个蛋白存在交互,我用A的抗体拉A,理论上就应该能在沉淀物中检测到B(用WB的方法)。反过来,如果我用B的抗体拉B,也应该在沉淀物中检测到A,两个分子相互拉都能检测到对方,才能严谨的得出两者有交互的研究结论。所以解读co-IP的实验结果最关键的信息就在于用一个蛋白免疫沉淀的样品(IP)里,有没有另一个蛋白的信号,有条带就是有交互,没条带就是没交互。
在上图的co-IP典型结果里,input是细胞裂解液,里面什么都有,所以用A、B抗体去检测都有信号。IgG是跟抗体类似的但没有特异性结合的蛋白,用IgG去免疫沉淀,不会沉淀到A和B,是体系的阴性对照。而关键的实验结果是关注用A的抗体(anti-A)去免疫沉淀获得的样品里面有B的存在(上半图),或者用B的抗体(anti-B)去免疫沉淀获得的样品里面有A的存在(下半图),即红色箭头标注的组别有条带,就说明A和B之间存在结合。
当然,用A的抗体沉淀下来的样品中去检测A,必然是存在阳性信号的,这也可以看作是实验的阳性对照,如果用A抗体拉A都检测不到,那么体系就有问题了,不可能有B的信号,即使有也是假阳性。
还有一种情况叫外源co-IP,相对于目的细胞里面自身有A和B的内源表达和自然结合,外源co-IP是在工具细胞293中人为地制造A和B的过表达。
这样单独表达A或者单独表达B的分组里,是不存在成功的交互结果的,只有同时转染A和B的分组里,才有类似于内源的用A抗体拉到B和用B抗体拉到A的结果。
之所以会有外源co-IP是因为一个蛋白的特异性抗体也挺贵的,而我们没法一下子就猜对一组交互,还需要多个蛋白反复验证,这时候抗体费用算是不小的负担。外源表达的A和B可以接上蛋白标签,比如Flag,His,HA等,这样用标签抗体结合融合表达了标签的目的蛋白,可以用一组两个抗体,验证所有可能结合的交互蛋白分子,非常有效率。外源验证成功的两个分子组合,再去内源验证。