细胞爬片实验步骤

细胞爬片就是让玻片浸在细胞培养基内，细胞在玻片上生长。主要用于组织学，免疫组织化学，冰冻切片，细胞涂片，原位杂交等。

细胞爬片的准备    1.盖玻片的选择：

爬片可用一般的盖玻片，也可用专用细胞爬片（价格比较昂贵）但是细胞贴壁牢固，拍出照片效果好；

2.爬片的剪裁：

可根据自己的需要，到染色时再将之切开，这样既保证了细胞均一性，又可同时做几个指标的染色剪裁成合适大小，置于6孔板、12孔板或24孔板；

3.爬片的使用前处理：

将剪裁好的爬片，置于浓硫酸中浸泡并过夜，第二天先用自来水冲洗20遍，再置于无水酒清中浸泡6小时，再用三蒸水冲洗3遍（个人认为主要目的是将酸冲洗干净就可以了，如果不干净的话，细胞帖壁不好），放在饭盒或者玻璃培养皿中烘干后进行高压消毒。高压后取出放入烤箱中烤干，备用。烤干后可放入超净台中。

4.多聚赖氨酸的使用：

很多人都将玻片用此处理，以使细胞与玻片结合更牢。但我在做爬片时从来没用过多聚赖氨酸，细胞贴壁仍然很好，且在做后续的免疫细胞化学染色、TUNEL等凋亡检测、免疫荧光等也从未脱过片。

细胞爬片的操作

1.胰酶消化细胞后计数重悬细胞于完全培养基中。

2.加细胞前，根据玻片的大小，先在每个孔里准备放爬片的位置滴少量培养基，使玻片与培养皿靠培养基的张力粘合到一起，然后放玻片，防止加细胞悬液时玻片漂起，造成双层细胞贴片。(整个过程注意无菌操作)

3.根据自己的需要选择合适的细胞密度接入培养板内即可。

4.待细胞贴壁后，可去上清加含药培养基。

5.按照实验设计，作用一定时间后取玻片。取玻片时由于玻片与培养皿底结合较紧，张力较大，一般将注射器针头针尖向背面弄个小钩，这样将爬片轻轻勾起，用小镊子取出就可以了。如果要做诸如24h，48h，72h等这样时间点的实验的话，将所需数量的爬片取出时应用酒精灯火焰烧一下针头和镊子。末取出的可接着继续培养。

    细胞爬片的固定

另外在保存细胞爬片的时候，一般用培养皿或板，先在皿底放一层面巾纸，然后再放爬片，这样方便做实验时取片。

细胞爬片取出后，一般用PBS洗2遍，然后再做固定。当然，有例外，比如做凋亡的TUNEL染色时就避免洗，因为凋亡的细胞在洗的过程中有可能会脱落。    然后盖上盖子，并在盖子上做标记，为避免混淆，可用透明胶带将盖子和皿连在一起。一般-20℃保存2-3个月的片子做免疫组化是没有问题的。    常用的固定液

1.冷丙酮

——可用于一般的免疫组化染色。

——将纯的丙酮预先放入冰箱-20℃后便为冷丙酮（放心，丙酮在此温度不会为固体的）细胞爬片取出后，PBS洗2遍，便可加入冷丙酮于-20℃（丙酮有很强的挥发性，注意将含有丙酮和爬片的器皿盖严，防止其挥发）

——固定10分钟，取出后，室温吹干，然后放入-20℃保存。

2.多聚甲醛(常用4%)

——可用于免疫电镜、免疫荧光以及TUNEL染色。

——主要检测组织内一些性能娇弱的抗原特别是细胞表面抗原，例如各类淋巴细胸分化决定簇(CD)、主要组织相容性抗原等

——室温固定15分钟后，将表面液体吹干，入-20℃保存

3.95％乙醇

——可用于免疫组化。

——优点：穿透性强、抗原性保存较好。缺点：但醇类对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差，使蛋白变性的作用轻，固定后可再溶解；染色过程中，温育时间长，抗原可流失而减弱反应强度。

——室温固定15分钟后，将表面液体吹干，入-20℃保存

4.甲醛(福尔马林)

——应用广泛。

——优点：形态结构保存好，且穿透性强，缺点： 甲醛放置过久可氧化为甲酸，使溶液pH降低，影响染色； 分子间交联形成的网格结构可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇，使之不能充分暴露。可造成假阴性的染色结果

——室温固定15分钟后，将表面液体吹干，入-20℃保存。