《自然》：数肿瘤里的T细胞，这个工具太好用了！
近几年来，免疫治疗已经成为肿瘤治疗领域一项革命性的治疗手段[1]。不过，大量的临床实践证明并不是所有的肿瘤患者都会对免疫治疗产生应答，这种现象主要与肿瘤抗原水平和T细胞数量（免疫浸润程度）有关[2]。
尽管肿瘤抗原水平已经可以从全外显子测序（WES）数据中估计出来，但是对肿瘤免疫微环境中T细胞数量的预测仍然需要额外的样本数据[3]。
近日，英国伦敦大学癌症研究所Nicholas McGranahan领衔的研究团队在《自然》发表重要研究成果，他们开发了一个名为T cell ExTRECT的工具，能直接通过肿瘤组织样本或血液样本WES数据估计肿瘤免疫微环境中T细胞数量。
如果这一工具进入临床，将有助于医生快速判断患者是否响应免疫治疗，以便为患者制定更精准有效的治疗方案[4]。
论文截图
肿瘤免疫微环境影响着肿瘤的进展，它可以作为预测患者对免疫治疗的应答以及预后的分子标志物。已有的研究表明，T细胞越多，患者的预后会越好。因此对肿瘤免疫微环境中T细胞数量的估计有助于指导患者的治疗。
但常用的估计T细胞数量的方法都需要额外的RNA-seq数据。
目前，对肿瘤患者进行DNA测序已经是常规操作了，而DNA数据几乎只用于患者分类，以及了解肿瘤的发展过程。如果能直接从DNA测序数据中估计T细胞的数量，就有可能让合适的治疗方案快速实施。
McGranahan团队开发的T cell ExTRECT，就是这样一种可以直接从肿瘤组织样本的WES数据中估计T细胞数量的方法。
我们都知道，T细胞成熟过程中在T细胞受体（TCR）基因会发生V(D)J重组，这赋予了T细胞识别不同外来抗原的能力。例如，TCRA（T细胞受体-基因）会被切除一部分片段，形成一个切除环（TREC）。
不难看出，这就形成了一个类似于体细胞拷贝数变异（SCNA）的生物学事件。而T cell ExTRECT正是利用了这个事件，并且巧妙地借鉴了计算SCNA的工具的原理，利用TCRA的测序读段深度的比值（RDR）估计肿瘤样本中T细胞的数量（后文中由T cell ExTRECT估计的T细胞称为TCRA T细胞）。
测序读段深度的比值（RDR）原本反映的是肿瘤组织和对应的正常组织在测序深度一致时，肿瘤由于基因组发生体细胞拷贝数变异而出现一些片段扩增或缺失，使得这些片段的测序读段数异常。但在T细胞中RDR反映的则是TREC的形成，研究人员因此利用一个改良后的RDR实现了直接从WES数据中估计T细胞的数量。
T cell ExTRECT中改良后的RDR是测序深度和V(D)J区域读段中位数的比值
为了验证T cell ExTRECT的准确性，McGranahan和他的同事做了一些测试。首先他们分别计算了T细胞淋巴瘤（数据来源于JURKAT，PEER，HPB-ALL）和结直肠癌（来自于HCT116细胞系）样本中的TCRA T细胞比例，结果显示结直肠癌中TCRA T细胞比例接近于0，而T细胞淋巴瘤则接近于1，表明T cell ExTRECT能准确的判断样本中是否存在T细胞。
接着，McGranahan团队将他们的方法与另外一个利用DNA测序数据计算T细胞比例的类似方法进行了比较[5]。结果发现，在相同的数据中（TRACERx100队列），两种方法得出的结果有显著的相关性，但是T cell ExTRECT有更稳定的表现，而另外一种方法则受测序深度影响较大。
考虑到目前大部分用于估计微环境中免疫细胞组成的方法，都是基于RNA-seq，而真正受到认可的仍然是从组织病理学分析得到免疫细胞组成。
因此McGranahan团队在TRACERx100队列中将T cell ExTRECT以及6种基于RNA-seq的方法（Danaher，Davoli，xCell，TIMER，CIBERSORT，EPIC）和组织病理学的分析结果进行比较，发现T cell ExTRECT和组织病理学的分析结果有显著相关性。
T cell ExTRECT以及6种基于RNA-seq的方法与组织病理学方法的相关性
上述的分析过程证明了T cell ExTRECT的可靠性，那么这个工具是否可以利用任何样本的WES数据呢？
其中研究人员最关心的是血液样本，毕竟血液几乎是临床上最容易获得的生物样本，而且有大量的测序数据。最关键的是，这么好用的样本数据，目前还没有方法利用它分析患者的免疫状态。
因此，McGranahan团队便基于血液样本的WES数据深入探究了影响肿瘤组织中T细胞数量的因素。
还是TRACERx100队列，研究人员发现女性的血液TCRA T细胞比例显著高于男性，并且血液中TCRA T细胞比例与对应的肿瘤组织中TCRA T细胞比例呈正相关。这就为通过血液样本WES数据评估患者的免疫状况指导免疫治疗奠定了基础。
女性血液TCRA T细胞比例高于男性（左）
血液TCRA T细胞比例与对应肿瘤组织中的免疫浸润有关
为了进一步研究血液T细胞的影响因素，然后他们用食管上皮的正常组织（PNE）做了一样的分析，发现正常组织中的免疫浸润同样与血液TCRA T细胞水平相关。除此之外，病毒和细菌感染也会影响血液TCRA T细胞水平。
接下来，McGranahan团队调查了影响肿瘤组织中T细胞浸润的因素。
他们分析影响肿瘤组织中TCRA T细胞数量的因素时，使用的是一个多样本肿瘤病例队列数据（包含12种癌型，178个肿瘤，731个样本）。他们将肿瘤按照TCRA T细胞比例分成了“冷”（所有样本比例<0.11）、“热”(所有样本比例0.11)、“异质”型。
不同癌型之间三种类型肿瘤占比的区别较大，例如雌激素受体阳性乳腺癌是异质型肿瘤最多的癌型（83%），而肺鳞癌则是异质型肿瘤最少的（22%）。这表明，对于某些癌症类型，存在着高度的局部免疫浸润，因此肿瘤的冷热会受到采样偏差的影响。
各种癌型中不同类型肿瘤的占比
紧接着，McGranahan团队还研究了SCNAs和免疫多样性之间的关系。
他们发现肿瘤样本的SCNA异质性（同一个肿瘤不同样本间发生的不同SCNA）与TCRA T细胞比例有关，不同样本间SCNA的异质性越大，TCRA T细胞比例差异越明显。并且他们在超过30个肿瘤病例中发现12q24.31-32区域的缺失与TCRA T细胞比例的显著下降有关。
SCNA异质性与TCRA T细胞比例的关联（左），12q24.31-32区域的缺失造成TCRA T细胞比例下降
后续的RNA-seq分析发现12q24.31-32区域的缺失会导致SPPL3基因丢失，使得B2GNT5上调，导致细胞表面鞘糖脂增多，妨碍HLA发挥抗原呈递功能，最终使CD8 T细胞不能被激活。因此研究人员认为这可能是许多癌症中肿瘤细胞产生免疫逃逸的一个机制。
那么T cell ExTRECT究竟有没有潜在的临床应用价值呢？
为了体现T cell ExTRECT的临床应用潜力，McGranahan团队将TRACERx100队列中的非小细胞肺癌样本按照所有样本TCRA T细胞比例的均值（0.081）分成了冷热肿瘤。
他们发现，在肺腺癌中，同一个患者多次采样的肿瘤样本中具有的冷肿瘤特征的样本越多，预后越差；但肺鳞癌中并没有这样的现象。表明TCRA T细胞比例是肺腺癌患者预后的一个重要生物标志物。
具有越多冷肿瘤样本的LUAD患者生存期更短
最后，研究人员在CPI1000 队列中检验了TCRA T细胞比例预测患者对免疫治疗响应的影响。他们发现产生应答的患者肿瘤组织中TCRA T细胞比例更高，并且冷肿瘤主要分布在无应答患者群体中。
对免疫治疗有应答的患者肿瘤组织中TCRA T细胞比例更高
在对患者按照肿瘤突变负荷分类后，患者对免疫治疗的应答率仍然与TCRA T细胞比例有关。表明它们之间的关系与肿瘤突变负荷无关。
冷肿瘤显著富集于无应答患者，并且患者应答率与TCRA T细胞比例的关系和TMB无关
在综合了基于RNA-seq方法的结果后，研究人员认为T cell ExTRECT可以作为这些方法的替代技术，并且如果能够结合TMB数据，可以更好的预测免疫治疗应答率。
总的来说，McGranahan团队的研究开发了一个不需要额外的数据就能从肿瘤样本的WES数据估计T细胞数量的方法，并且可以应用于血液样本的T细胞比例估计，这在以往是无法做到的，将有望提升肿瘤患者的精准医疗水平。不过，这个方法也有一些局限性，它不能区分被肿瘤抗原激活和未激活的T细胞，并且在测序深度小于30x时精确度会下降。
参考文献：
[1] Robert C, Thomas L, Bondarenko I, et al. Ipilimumab plus dacarbazine for previously untreated metastatic melanoma. N Engl J Med. 2011;364(26):2517-2526. doi:10.1056/NEJMoa1104621
[2] Litchfield K, Reading JL, Puttick C, et al. Meta-analysis of tumor- and T cell-intrinsic mechanisms of sensitization to checkpoint inhibition. Cell. 2021;184(3):596-614.e14. doi:10.1016/j.cell.2021.01.002
[3] Rosenthal R, Cadieux EL, Salgado R, et al. Neoantigen-directed immune escape in lung cancer evolution. Nature. 2019;567(7749):479-485. doi:10.1038/s41586-019-1032-7
[4] Bentham R, Litchfield K, Watkins TBK, et al. Using DNA sequencing data to quantify T cell fraction and therapy response [published online ahead of print, 2021 Sep 8]. Nature. 2021;10.1038/s41586-021-03894-5. doi:10.1038/s41586-021-03894-5
[5] Levy E, Marty R, Gárate Calderón V, et al. Immune DNA signature of T-cell infiltration in breast tumor exomes. Sci Rep. 2016;6:30064. Published 2016 Jul 25. doi:10.1038/srep30064
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