Nature 综述 | 基因治疗全解析

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来源：美柏医健

作者：cageling

基因治疗是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿缺陷和异常基因引起的疾病，以达到治疗目的。在过去的几十年里，基因治疗领域在治疗以前无法治疗的遗传疾病方面取得了重大进展。

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基因治疗靶点和策略

基因治疗技术旨在治疗多种人类疾病，包括显性和隐性遗传疾病、癌症、心血管疾病和神经退行性疾病。基因疗法在治疗隐性遗传疾病方面取得了成功。目前正在进行的一些隐性疾病基因治疗试验额血液疾病如镰状细胞病和血友病、囊性纤维化、大疱性表皮松解症和视网膜营养不良如莱伯氏先天性黑内障（Leber’s congenital amaurosis，LCA)。

基因治疗还可以针对显性遗传疾病。由功能显性获得或显性阴性突变引起的显性遗传疾病需要敲低突变蛋白。一种常见的敲除方法是RNA干扰(RNAi)，通常使用小干扰RNA分子(siRNA)。目前有几种针对这些疾病的基因疗法，包括Tmc1突变引起的常染色体显性非综合征性听力损失、肌萎缩性侧索硬化症和1A型显性肢带型肌营养不良。

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FDA/EMA批准临床使用的基因疗法

虽然有许多基因治疗的临床试验在进行中，但是目前获得FDA和/或EMA批准临床使用的基因疗法只有四种，具体见表1。

表1    目前FDA和EMA批准的基因疗法

注：“费用”指单次治疗费用

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基因组编辑技术

治疗遗传疾病更持久的策略是利用基因组编辑技术，如转录激活子样效应因子核酸酶技术(TALENs)、锌指核酸酶(ZFNs)和CRISPR-Cas9。由于CRISPR-Cas9技术设计较容易，以及它们在当前研究中的广泛应用，本文将重点讲述CRISPR-Cas9技术（图1）。

图1    CRISPR-Cas9用于基因组编辑

CRISPR-Cas9复合物来源于细菌和古细菌适应性免疫系统，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。化脓性葡萄球菌的CRISPR-Cas9系统可以在哺乳动物细胞中产生靶向双链DNA断裂，这一发现开启了基因工程的一场新革命。通过在基因组DNA中创建双链断裂，位点定向内切酶可用于在DNA中创建位点特异性的、可遗传的变化，然后通过非同源端连接(NHEJ)或同源定向修复(HDR)进行修复。通常，双链断裂对细胞极其有害，因为它们会导致染色体重排，最坏的情况下会导致肿瘤发生。然而，在基因编辑治疗人类疾病时，NHEJ和HDR都有巨大的利用潜力，通过确定致病基因增强对疾病的理解，以及基因沉默或纠正致病突变基因从而直接治疗疾病。

利用体外CRISPR-Cas9基因编辑技术改造诱导多能干细胞(iPSCs)已成为一种越来越有用的治疗疾病的工具。例如，CRISPR-Cas9矫正的自体iPSCs目前正在用于遗传性视网膜病变的治疗。一项研究表明，导致视网膜病变(如视网膜色素变性和莱伯氏先天性黑内障)的突变可以在患者特异性干细胞中得到矫正。矫正后的诱导多能干细胞可在体外分化并移植回视网膜。

除了利用CRISPR-Cas9的核酸酶活性诱导HDR和NHEJ治疗疾病外，还有大量的研究利用失活Cas9(dCas9)与反式激活蛋白结合以微调基因表达。将转录激活因子或抑制因子与dCas9蛋白连接，可以调节特定基因表达上调或下调(图2 a、b)。例如，在炎症性肠病和红斑狼疮等自身免疫性疾病BACH2和IL6ST等基因表达上调，dCas9连接DNMT3A可以下调BACH2和IL6ST等基因，具有潜在积极的治疗作用。

图2   dCas9调控基因表达

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基因治疗载体和递送

有许多方法可以作为基因治疗的载体，包括病毒和非病毒载体，每一种都有其自身的安全性和有效性。

病毒载体

最常见的病毒载体包括腺病毒(AdVs)、腺相关病毒(AAVs)、逆转录病毒和慢病毒，而其他病毒如单纯疱疹病毒和痘病毒也受到了一些关注。

AAV治疗疾病的成功案例颇有希望，其中最广为宣传的疗法是通过AAV2载体传递RPE65治疗LCA，它使得一些患者的视觉功恢复能，并产生了持久的积极效果。

尽管AdV载体具有强大的免疫原性作用，但它仍然是实验模型甚至癌症等疾病基因治疗的常见选择。2004年，一种表达p53的重组AdV载体，名为Gendicine，被中国国家食品药品监督管理局批准用于头颈部鳞状细胞癌的治疗。

慢病毒是基因和细胞治疗的常见载体。慢病毒不同于AdVs和AAVs，它可以整合到宿主基因组中，从而使转基因得到稳定和长期的表达。虽然整合到宿主基因组有它的好处，但也有插入突变的内在风险。Kymriah (tisagenlecleucel)是一种FDA批准的CAR-T细胞疗法，用于治疗B细胞急性淋巴细胞白血病，该细胞就是使用慢病毒生产的。一些正在进行的基因治疗临床试验也使用慢病毒载体，其中许多是针对造血干细胞来治疗疾病，如B细胞恶性肿瘤、原发性免疫缺陷和血红蛋白病。

非病毒载体

除了病毒载体外还有许多非病毒载体被用来递送基因，包括电穿孔、基因枪、流体压力、声孔效应、磁转染、脂质体、纳米颗粒和细胞穿透肽。

纳米颗粒是基因治疗中最常用的非病毒载体之一。壳聚糖是一种可降解的阳离子多糖，具有良好的耐受性，免疫原性和细胞毒性较小。这种传递系统已被作为载体在眼睛、胃肠粘膜和肝脏等器官组织中进行测试。在一个实验中，将包裹编码IL-12质粒的壳聚糖纳米颗粒注射到小鼠肿瘤中，显著抑制肿瘤生长并诱导肿瘤组织凋亡。近年来，壳聚糖已被用作基因的递送方法治疗帕金森病等神经退行性疾病。

基因治疗的另一类非病毒载体是外泌体。外泌体是细胞中自然形成的包膜小泡，对细胞的许多过程都很重要，包括遗传物质的运输。外泌体已被用于治疗软骨损伤和骨关节炎、癌症、心血管疾病等多个基因治疗实验。

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基因治疗面临的挑战

基因治疗最重要的问题之一是安全性。尽管人们普遍认为AAVs具有高安全性和低免疫原性，但AAVs已在多种动物模型中被证明可引发免疫反应。免疫反应有时可能是由于病毒携带的转基因，而不是病毒衣壳本身。例如，使用rAAV2将半乳糖苷酶传递给野生型实验犬会显著激活体液免疫。在同一研究中，作者发现空载体并没有引起这样的免疫反应。

CRISPR-Cas9介导的基因组编辑带来了独特的安全挑战，尤其是对脱靶效应的担忧。这些脱靶事件可导致必要基因(如肿瘤抑制基因)发生危险突变，并导致基因组不稳定。在为特定基因设计gRNAs时，必须谨慎选择。

治疗遗传性异质疾病所面临的第一个挑战是确定致病基因。从历史上看，尽管在使用更便宜、更容易识别特定致病突变的方法方面已经取得了很大进展，高通量测序平台大大降低了全基因组和外显子组测序的成本，到2019年，全基因组测序的成本约为1000美元，但是确定致病基因仍然具有挑战性的。

除了与基因鉴定相关的挑战之外，基因疗法在进入市场之前必须经历的严格过程是非常昂贵和困难的。目前估计一种新药上市的临床试验费用在1.61亿美元到20亿美元之间。例如，FDA批准治疗RPE65引起的视网膜营养不良的基因疗法Luxturna (voretigene neparvovec-rzyl)截至2017年的成本为85万美元。虽然这种治疗可能为接受治疗的患者的生活质量提供显著的飞跃，但这种经济负担的影响尤为明显。另一种FDA批准的基因疗法Eteplirsen使用反义寡核苷酸纠正导致DMD的异常剪接，每年每个患者的费用高达30万美元。

简单而言，基因治疗旨在为特定基因突变的患者提供这些基因的功能拷贝。但在过去的几十年里，基因治疗已经变得复杂得多，在某些情况下可能只是需要微调基因的表达，以改善遗传疾病的特征。虽然在基因治疗方面取得了许多进展，但该领域仍存在许多挑战。在基因治疗成为遗传病患者治疗的一线选择之前，还需要做更多的工作，特别是在开发安全和有效的载体和递送方法方面。然而，我们相信，在不久的将来，这类疗法将成为个性化治疗的主要手段，并将对遗传病患者及其家庭产生巨大的积极影响。

文章参考来源

Gene therapy and gene correction: targets, progress, and challenges for treating humandiseases, https://doi.org/10.1038/s41434-020-00197-8.