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（本研究中，作者通过WGCNA分析寻找与CD8T细胞负相关的基因，以此类推，我们也可以通过这个方法寻找与巨噬细胞等其他免疫细胞密切相关的基因/基因集）
发表杂志：Oncoimmunology.
影响因子：8.112
研究背景
流程图
分析解读
数据收集及处理
①从山东大学口腔医院收集临床标本。
②基因综合表达数据库（GEO）和癌症基因组图谱（TCGA）下载RNA序列。
③UCSCXena、UALCAN、TIMER2和MEXPRESS数据库下载临床和DNA甲基化数据。
④通过CIBERSORT和EPIC数据库分别获取22种免疫细胞类型和6种细胞类型的浸润水平。
⑤TIMER2数据库可视化YKT6表达或CNV与HNSCC中免疫浸润水平的相关性。
WGCNA分析和生物学功能、通路注释和基因集变异分析(GSVA)
①结合CIBERSORT估计的CD8+T细胞水平与临床特征，并移除了异常样本以执行WGCNA。
②采用β=7（无标度R2=0.8）作为软阈值来实现无标度网络。
③使用动态树切割方法鉴定了27个基因共表达模块。
结果：
下图a：红色模块与OSCC中pN分期和CD8+T细胞浸润高度相关。
下图b：红色模块中基因的基因本体分析。
下图c：红色模块中基因的KEGG通路富集分析
下图j-k：对来自GSE30784和GSE41613数据集的YKT6高表达和低表达样本中标志和KEGG通路基因集的GSVA分析；*p<0.05，**p≤0.01，和***p≤0.001
YKT6作为枢纽基因并构建预后模型
①对TCGA-HNSCC组别的基因表达数进行差异分析
②将YKT6表达和肿瘤分期整合到多变量Cox回归模型中开发预后列线图，并使用TCGA、GSE41613和GSE42743进行评估和验证。
③基于当前研究中开发的列线图评分，以预测个体患者的1、3、5和7年OS。
结果：
下图a：上调差异表达基因（DEG）与来自WGCNA选定基因的交叉点的维恩图。
下图b：来自WGCNA的29个常见基因和OSCC样本中的差异表达分析。在TCGA-HNSCC队列中，六个基因的上调也与OS/PFS降低有关。
下图c-d：Ranger仅为TCGA-HNSCC患者提供了两个基因的VIS。模型中这些基因的OOB错误率，当基因根据其VIS等级被包含时，选择根据预后重要性排在前列的基因进行进一步分析。
下图e：GSE41613、GSE42743和TCGA队列中YKT6水平与年龄、性别、肿瘤分期和HPV状态的单变量和多变量Cox回归分析。
下图f：YKT6对三个队列患者预后价值的荟萃分析。
下图g：多变量Cox回归分析列线图预测OS患者比例。
下图h：绘图根据预测和观察到的OS之间的一致性描述了模型的校准。
下图i-k：针对TCGA、GSE41613和GSE42743数据集中基于诺模图的特征、YKT6表达和肿瘤分期的不同OS持续时间绘制的AUC曲线。
YKT6在公开数据集中的HNSCC/OSCC样本中表达及甲基化水平
①根据不同临床因素分类的MEXPRESS组中评估YKT6在HNSCC恶性肿瘤中的作用。
②根据分子和免疫特征将HNSCC分为不同的亚型。
③分析单细胞RNA测序数据集的HNSCC不同细胞类型中YKT6的表达。
结果：
下图a-b：YKT6水平与临床病理特征（包括HNSCC亚型）之间的相关性。
下图c-e：箱线图显示不同级别的YKT6表达、HPV感染状况、来自UALCAN数据库的HNSCC样本的TP53突变状态。
下图f-i：TCGA数据库中不同亚型HNSCC组织中YKT6mRNA表达的分析。
下图j：分析来自GSE30784数据集的OSCC和正常对照组织中YKT6的mRNA表达。
下图k：来自GSE78060的转移淋巴结和正常口腔组织中YKT6 mRNA的定量。
下图l-m：GSE30784和GSE41613数据集中YKT6 mRNA表达与免疫评分和肿瘤纯度之间的相关性。
下图n：如cBioPortal使用TCGA-HNSCC数据分析，缺失、二倍体、拷贝数增加和扩增参与YKT6表达的失调。
下图o：YKT6 CNV与mRNA表达之间的相关性。
下图p：使用TCGA-HNSCC队列研究YKT6的CNV在23条染色体上的位置。
下图q：来自UALCAN-HNSCC队列的正常对照和肿瘤组织中DNA甲基化值的差异。
下图r：MEXPRESS-HNSCC队列中YKT6表达与DNA甲基化水平的相关性。
YKT6表达与免疫相关性
①使用R包“ESTIMATE”评估了肿瘤样本的免疫评分、肿瘤纯度和基质评分。
②每个样本中37个免疫和肿瘤相关特征的水平通过使用R包“GSVA”的单样本基因集富集分析（ssGSEA）进行量化。
③为了进一步阐明YKT6在免疫治疗（以ICB为代表）的背景下的作用，作者将分析扩展到YKT6与几个众所周知的免疫检查点基因之间的关联。
结果：
①YKT6的高表达与低CD8+T细胞渗透水平相关。
下图a：YKT6的mRNA表达与TIMER2数据库中HNSCC、HNSCC HPV阳性和HNSCCHPV阴性的CD8+T细胞浸润水平呈负相关。
下图b：YKT6的CNV与TIMER2数据库中HNSCC、HNSCC HPV阳性和HNSCCHPV阴性数据库中CD8+T细胞水平呈负相关。
下图c-e：YKT6的mRNA表达与GSE30784和GSE41613中CD8+T细胞浸润水平呈负相关。
下图f：YKT6和CD8高蛋白和低蛋白表达的IHC图像。比例尺：100μm。红色箭头代表CD8+T细胞浸润到肿瘤中。
下图g-h：OSCC组织微阵列芯片1(n=48)和芯片2(n=35)中YKT6和CD8 IHC染色的量化显示YKT6和CD8之间的负相关。
下图i-k：在TIMER2-HNSCC、GSE30784和GSE41613中，YKT6表达与趋化因子和趋化因子受体表达呈负相关。
下图l-n：YKT6的mRNA表达与TIMER2-HNSCC、GSE30784和GSE41613中免疫检查点分子的表达水平呈负相关；ns，不显着，*p<0.05，**p≤0.01，和***p≤0.001。
②YKT6表达可以预测ICB。
下图a：GSE30784、GSE41613队列中YKT6表达与免疫特征之间的负相关。
下图b：YKT6的mRNA表达与GSE30784和GSE41613中的TIDE评分相关。
下图c：GSE30784和GSE41613队列中来自TIDE的推定免疫治疗反应组与无反应组中YKT6表达的BoxViolinplot表示。
负相关
下图d-e：YKT6与GSE30784和GSE41613中MHC、EC、SC、IPS评分的相关性。
下图f-g：YKT6低组可能对GSE30784和GSE41613中的抗PD-1治疗更敏感。
下图h-i：GSE41613和GSE42743中YKT6的AUC、TIDE响应和OS的IPS分数的比较。
下图j-k：YKT6在GSE35640和GSE91061队列中具有不同免疫治疗反应的患者的分布。
下图l-m：GSE35640和GSE91061队列中ICB客观反应预测值的ROC曲线。
YKT6在泛癌中的表达及免疫治疗反应预测和药物敏感性探索
①评估了YKT6在除HNSCC以外的31个实体瘤中的表达。
②为了以及YKT6表达与肿瘤内免疫状态之间的关联，分析了六种免疫亚型中的YKT6表达。
③使用单变量Cox回归分析在包含9,163个肿瘤样本的独立TCGA癌症队列中验证了YKT6表达对OS和PFS的预后价值。
④检查YKT6表达在药物敏感性中的作用。
结果：
下图a：从TCGA数据库评估肿瘤和正常对照组织之间YKT6的mRNA表达。
下图b-f：YKT6与免疫评分和肿瘤纯度水平以及来自TCGA数据库的人类实体癌中一些癌症相关特征的关联。
下图g：YKT6与来自TCGA数据库的人类实体癌中活化的CD8+T细胞水平和免疫相关评分的相关性。
下图h：单变量Cox回归分析估计来自TCGA数据库的YKT6在不同癌症类型中的预后价值(OS/PFS)。
体外实验验证
①蛋白质印迹（Western blotting）和免疫组织化学(IHC)染色
②细胞培养、瞬时转染、RNA提取和实时定量PCR(qRT-PCR)
③划痕实验和Transwell检测
④酶联免疫吸附试验(ELISA)
结果：
①YKT6表达在临床OSCC样本中表达上调。
下图a：通过Western blotting测量的八对OSCC组织（T）和相邻非肿瘤组织（N）中YKT6的蛋白质水平。
下图b-f：邻近非肿瘤组织、OSCC组织的不同pN阶段和有/无肿瘤转移的LN组织中YKT6的IHC染色图像。
下图g：在不同组织学等级的OSCC组织中YKT6的IHC染色的代表图像。
下图h-i：不同组织学等级OSCC组织中YKT6 IHC染色的定量。
②YKT6在体外促进OSCC细胞迁移和侵袭。
下图a-c：NC和YKT6敲低组划痕实验图像。
下图d：伤口闭合的定量分析。
下图e-g：NC和YKT6敲低组中细胞迁移和侵袭图像。
下图h-j：细胞迁移和侵袭OSCC细胞数的定量分析。
下图k-m：在用siRNA转染的OSCC细胞中通过蛋白质印迹分析验证MMP9表达。
下图n-p：在转染siRNA的OSCC细胞中通过ELISA测量的细胞培养物上清液中的TGF-β1浓度，*p<0.05，**p≤0.01，和***p≤0.001。
小结：
在本项研究中，作者为了深入了解OSCC进展机制和对免疫治疗的反应，进行WGCNA以探索与肿瘤转移和CD8相关的关键模块和T细胞浸润水平，随后，作者利用差异表达分析和预后分析确定了YKT6为枢纽基因，并进行泛癌分析、临床预后分析、药物敏感性分级及体外实验验证。最终结果显示YKT6具有作为预后生物标志物和OSCC免疫治疗指标的潜在价值。