净水技术 | 胞外DNA在生物膜形成及发展过程中的作用

近期征稿火热进行中1净水技术|《净水技术》“县镇级供排水企业技术进步成果专栏”征稿通知2净水技术|《净水技术》“城镇给排水工程设计案例”专栏征稿通知3【征稿通知】《净水技术》“水质检测方法的创新与应用”专栏征稿通知

在自然环境中，作为独立生命体的单个细菌，趋向于建立多元化的细胞集合体以更加高效地对外界刺激进行协同反应。在水环境中，很多个单独的细菌包裹在自身分泌的胞外聚合物中，形成了前面所讲的细胞集合体，即生物膜，也称为菌膜。它的存在对于水处理具有双重意义：从水质净化角度来说，细菌自身代谢可以去除水中的污染物，有利于净化水质；另一方面，细菌存在于水中特别是饮用水中，本身就存在风险，在水处理系统中造成的膜堵塞或生物腐蚀问题都是不利的，且由于胞外聚合物的复杂性，生活在其中的细菌难以被清除。事实上，人们对于细菌胞外聚合物的认识是一个逐渐变化的过程。最初“EPS”所代表的含义，并非现在的胞外聚合物。起初，人们认为胞外聚合物成分是多糖，“EPS”也仅代表胞外多糖(exopolysaccharides)一词的缩写。后来的研究显示，胞外成分中多糖并非唯一物质，除此之外还包括胞外DNA(extracellular DNA，eDNA)、胞外蛋白等，所以目前普遍认为“EPS”是复杂的胞外聚合物。EPS各组分含量随菌种和环境有所不同，主要组成物质有胞外蛋白、胞外多糖、eDNA等，其中蛋白和多糖的含量占EPS总量的75%～80%，而eDNA含量最高可达15%。eDNA是EPS中的重要组成成分之一，关于它与细胞成膜的功能相关性由Whitchurch等在2002年首次提出。自此开始，人们通过数个门类多个菌属的研究，发现eDNA会参与调节生物膜形成的过程，维持生物膜的空间稳定性。eDNA作为细菌生物膜形成的黏附物质，参与维持生物膜结构稳定性已经是一个比较普遍的结论，但是其背后的机理以及在水处理、生物冶金、医学及食品安全方面等的相关研究并不统一。在此，本文综述了迄今为止有关eDNA的来源以及调控其分泌的机制、在生物膜形成及发展过程中的作用、证明eDNA发挥其重要功能的潜在机制的研究结论，并讨论了eDNA成为抑制微生物的新靶点的可能性。01eDNA的来源及其调控机制部分关于细菌eDNA的产生途径及其调控机制的研究如表1所示。就目前的研究而言，细菌eDNA的来源和调节机制有系统性的成熟理论，就其来源而言大概可以分为3类。表1 eDNA释放途径及调节机制

1.1 主动分泌Hamilton等的研究中，首次发现在淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)细胞内有一种特殊的IV 型分泌系统(T4SS)，具有主动分泌DNA的功能。通过该系统，淋病奈瑟菌能够将染色体分泌到细胞外。需要指出的是，该系统在革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌中均存在。经过该系统分泌出来的DNA在基因水平传递方面优于细菌自溶菌作用释放的DNA。1.2 自溶素裂解囊泡释放Saunders等在关于铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的研究中发现，该菌种会释放含有DNA的小囊泡，当小囊泡到达细菌细胞外时，自溶素通过裂解小囊泡增加eDNA含量。关于幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)的研究中也发现了类似的现象，且维持细胞之间或细胞与载体表面之间的直接接触有利于增加囊泡含量。最近关于变形链球菌(Streptococcus mutans)的研究表明，糖基转移酶能够调节该小囊泡的含量。因为调控该酶的基因敲除后，囊泡的分泌量增加了，eDNA含量也随之增加。囊泡导致胞外eDNA含量变化的情况多有报道，但是什么因素导致外囊泡的含量增加尚没有定论。1.3 细菌裂解释放迄今有关eDNA来源的研究中，诸多报道指出，主动分泌是eDNA的最主要来源。研究表明，细菌通过类似于真核生物程式化地以一个亚种群导致另一个亚种群的分解这种方式使胞外成分中eDNA含量增加；关于铜绿假单胞菌和肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的研究显示，噬菌体能导致细菌的溶菌作用，进而释放eDNA；Gili等和Zheng等研究表明，其他链球菌中产生的过氧化氢也会导致细菌裂解，是eDNA的来源之一。1.4 eDNA的调节机制与表1中列出的部分细菌EPS的调节机制的描述类似，关于eDNA含量调节的研究表明，细菌EPS的调节机制并没有完备的理论。目前，已知部分菌种的eDNA含量受群体感应系统(quorum sensing，QS)的调控。Das等将这种感应调节系统概括为QS-独立系统和QS-依赖系统。在这两种系统中，QS-独立系统是eDNA释放的基础原因；而QS-依赖机制依赖于信号分子的调控，通过调控前噬菌体、吩嗪的释放，促进eDNA的释放。这里所说的QS信号分子主要包括革兰氏阴性菌的N-乙酰高丝氨酸内脂信号分子和革兰氏阳性菌的寡肽类信号分子等。革兰氏阴性菌QS系统通过调节N-乙酰高丝氨酸内脂的浓度，使得细菌释放前噬菌体和吩嗪，诱导eNDA的释放；革兰氏阳性菌QS-依赖机制通过调控寡肽类信号分子合成蛋白质、酶和多肽，诱导其释放。此外，水动力、抗生素等的胁迫也会致使eDNA的释放。如Pemmaraju等研究了氧化胁迫对白色念珠菌(Candida albicans)生物膜形成的影响，结果显示，白色念珠菌对氧化作用的应激反应能够促进细胞DNA释放到细胞外。02eDNA与细菌细胞黏附有关eDNA在细菌形成生物膜过程中作用的研究表明：eDNA的存在促进了该过程中细菌向生物或非生物表面的黏附作用。生物膜形成的第一步是单个细菌黏附到载体表面，普遍认为这个过程包含两个不同的阶段。第一阶段：细菌细胞由于其表面的物理化学特性，像惰性胶体粒子一样开始接触到载体表面；第二阶段：微生物产生的黏附剂将其牢固地固定在载体表面，随后聚集、增殖，逐渐形成具有一定规模的成熟生物膜。第一阶段相对来说是一个时间较长且可逆的过程，且这个阶段的黏附很不稳定，细菌在接触到载体表面刚开始黏附的过程中，由于外部扰动等原因会不断地脱离表面。这个过程受范德华作用力和细菌与基质双电层重合部分所产生的排斥力的影响，因为细菌细胞表面和载体表面通常都带负电，这种相互作用的结果是相互排斥的。第二阶段发生在更小的空间尺度上，且更加具有特异性：配体和受体分子之间相互作用形成牢固的结构，这样便产生了从吸引到黏附的本质上的变化。由于这种变化，细菌和载体之间的黏结才会更加稳定。Boks等借助原子力显微镜对这一阶段的前后进行了对比，吸附强度确实增大了。而eDNA可以作为细菌细胞与载体表面之间沟通的桥梁，突破细菌细胞与载体表面分离的能量壁垒，这样便可促进第二阶段的黏附在更大的空间尺度上进行。Das等的研究中验证了这一点：单个细菌吸附到载体表面存在一个长达300 nm的长循环结构。300 nm的距离足以忽略在第一阶段的微弱的排斥力和载体表面之间的能量壁垒，即由于eDNA的存在，使原本需要靠近到几十纳米才有可能黏附的条件拓宽到了300 nm左右。在此距离尺度上，就能开始第二阶段的相互作用，将细菌固定起来，这种作用对于细菌形成生物膜有极大的促进作用(图1)。

图1 eDNA参与促进细胞克服能量壁垒疏水性也是影响细菌是否易于黏附到载体表面的因素之一。众多学者通过测定接触角来衡量eDNA的存在与否对细菌表面的亲疏水性是否有影响。Das等证明，eDNA的存在的确使细菌表面具有高度疏水性，这种疏水性差异说明eDNA的存在可以使细菌细胞向其他表面靠近，促进初期黏附。这些研究支持这样一个观点：eDNA的存在促进了细菌向其他载体表面黏附形成生物膜。也有研究发现，在载体表面预涂鲑鱼精子细胞的DNA会使铜绿假单胞菌初期黏附含量减少，这可能是因为细胞表面本来就具有eDNA，预涂在载体表面的DNA与细菌表面的eDNA都具有电负性而产生了排斥作用。在细菌向载体表面黏附的过程中，存在着大量且复杂的相互作用，既有促进也有抑制其向载体表面黏附。目前的研究结果显示，eDNA的存在可促进细菌向载体表面黏附。03eDNA与细胞的结构稳定性eDNA作为EPS关键组分之一，对于维持生物膜的空间结构具有极其重要的作用。细菌细胞黏附到载体表面后开始增殖且分泌大量的EPS。eDNA和细菌EPS中的其他成分如蛋白质等相互交联，形成牢固的结构，维持生物膜的空间结构及其稳定性(图2)。在超滤等膜滤工艺中，跨膜压差的增大，除了杂质的积累，常常是因为细菌形成生物膜。相较于杂质的积累，生物膜造成的膜污染更难清洗，其原因在于，生物膜中的细菌由EPS交联而形成稳定结构，抗菌药物难以起到想象中的作用。因此，设法破坏生物膜结构不失为一条可取之路。

图2 eDNA与胞外蛋白及胞外多糖交联Puga等的研究表明，在成熟的生物膜中单独加入核酸酶(Dnase I)后，胞外成分的eDNA含量和蛋白质含量均大幅度下降。单独添加蛋白酶(pronase)后，也出现了类似的结果，这个现象说明在成熟的生物膜中，eDNA会与蛋白质交联起来。Das等也指出，DNABII蛋白会与eDNA结合，对于利用eDNA作为基质成分的细菌群落的结构完整性至关重要，且外源性蛋白质的添加增强了eDNA与蛋白质的交联，进而有利于生物膜的形成。Yeon等研究发现，在金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)中，eDNA以一种依赖于基质蛋白的方式与细胞结合，且需要eDNA将细胞连接在生物膜中。这些结果与后来的研究一致。除了与蛋白质的交联，研究发现，胞外多糖也会与eDNA交联。Jennings等的生物研究结果表明，Pel胞外多糖通过离子相互作用将eDNA交联在生物膜“茎”处，即与菌胶团中心细胞及外界溶液都不直接接触的EPS中的区域。数据显示，Pel胞外多糖的阳离子电荷不同于其他已知的铜绿假单胞菌外多糖，有助于它与其他关键生物膜基质成分相互作用。与之类似，Wang等的研究则表明，多糖Psl与eDNA的这种相互作用使两种成分结合在一起，形成了一个eDNA-Psl纤维网，这种纤维网类似于位于胶团中心的生物膜骨架，为细菌提供支持结构。此外，在微菌落开始形成阶段，流动细胞生物膜中也发现了eDNA-Psl纤维的网状结构。这些研究成果说明，生物膜基质中所包含的各种成分之间并非孤立存在的，而是以各种已经认知到的和尚未认知到的方式相互作用，形成特定的结构。从现有报道来看，这种相互作用对于维持生物膜的空间结构有积极意义。值得一提的是，尽管大量文献已报道了eDNA的确存在于生物膜基质中，在促进细菌成膜中，胞外蛋白所起的作用似乎要比eDNA更为关键。在维持成熟生物膜的结构稳定性方面，相较于eDNA，胞外蛋白也扮演着重要的角色。但eDNA在细菌成膜过程以及维持结构稳定性方面是不可或缺的。04eDNA为细菌提供保护屏障细菌生物膜中水分含量可高达97%；除了水和细菌外，生物膜的细菌胞外物质包含蛋白质、多糖、肽聚糖、DNA、脂、磷脂等物质。这些成分可以作为细菌生命活动所需的营养物质，帮助细菌渡过如干旱以及营养贫乏的困难时期，是细菌合成代谢的最直接的营养物质来源。但是研究表明，其作用远不止如此。eDNA在金属离子、氧化性物质的胁迫以及宿主免疫系统的攻击中，都表现出了很强的保护作用。Lin等在关于恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida CZ1)的研究中发现，当环境中有Cu2+存在时，eDNA的含量会升高到相当于无Cu2+状态下eDNA含量的10倍，这个含量甚至比细菌细胞内的含量还要多，且会在胞外形成类似于Cu3(PO4)2的配体。细菌的这种行为将胞外金属离子对自身的影响降到了自身能够接受的水平，能够有效存活下来。通常认为，胞外成分对于生物膜内细菌的保护能力是源于抗生素与胞外的蛋白和多糖的相互作用，以此减少进入生物膜内部的抗生素含量。因此，相较于浮游状态的同种菌种，生活在生物膜中的细菌对同样浓度的同类抗生素具有更强的抵抗能力。eDNA具有很强的螯合阳离子的能力，可通过螯合宿主免疫系统分泌的阳离子抗菌肽，起到直接保护细菌免受抗菌肽攻击的作用。05eDNA作为细菌的外源基因的来源自1928年首次在实验室观察到肺炎双球菌(Diplococcus pneumoniae)毒力基因的细胞间基因水平传递以来，人们逐渐认识到大多数细菌基因组的相当一部分是水平基因传递获得的。水平基因传递是细菌进化的新基因材料的关键构成部分。细菌生物膜中发现的大量的eDNA为自然发生的遗传转化提供了丰富的资源，是移动遗传元件和噬菌体诱导的基因转移的唯一选择。Stewart等将灭活的细菌细胞和等量的DNA溶液分别加入到同样的施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)菌液中，检测各自标记物的含量，发现加入灭活的细菌细胞的试验组中，基因传递的水平要高于另一组约1000倍。这一观察开启了对DNA供体细胞在生物膜中作用的研究，形成了生物膜中细胞主动向周围原核生物提供DNA的结论。地球上大多数细菌都具有eDNA，而eDNA适用于基因水平转移。目前，基因转移在生物膜中以提高效率的方式已被证实，且细菌生存能力与eDNA的释放和随后生物膜的形成密切相关。这些研究表明，目前基于依赖微生物抗性基因降解水体中微污染物的做法存在的环境风险太高，并不可取。06结论与展望截至目前，已经有很多学者对于微生物形成生物膜的过程中eDNA所扮演的角色进行了大量研究，揭示了eDNA的形成机制和它在微生物生命活动中的作用，进一步认识到微生物的生命历程。但关于eDNA的研究还存在一定的局现性，有待更深层次的研究。(1)目前，研究绝大多数都局限于单一菌种。而自然界中，微生物往往是多菌种混合存在的，这些孤立菌种的研究固然能说明一些问题，但它跟自然状态下存在的混合菌种有何差异并不能确定。微生物的世界是一个复杂的环境，各种微生物间的相互作用与信息交流是否有eDNA参与，单一菌种环境是无法解释的。(2)研究结论并不总是一致的，结论产生矛盾的地方缺乏进一步的研究。在相关文献的报道中不难发现，同样的研究有时会得出相反的结论，如Yu等的研究表明，向形成的生物膜中加入蛋白酶不会破坏生物膜的完整性，而脱氧核糖核酸酶(DNase I)可以分解生物膜；Sugimoto等则得出了相反的结论。不同的菌种、不同的培养条件可能会导致试验结果的不同，应当去探索这种差异的内在原因。(3)关于水动力对eDNA的影响进而造成生物膜理化特性变化的研究不足。自然界中绝大多数微生物生活在湿润环境中，而关于这方面的影响规律及影响机制研究尚且不多。微生物环境是一个成分复杂的体系，与人类健康和生态平衡息息相关。作为生物膜基质中的主要功能性成分之一，eDNA在微生物对环境及人类健康的影响应当受到重视，利用新的手段和技术，全面深入地了解其作用及机制应当是今后的研究方向。来源：《净水技术》，仅供分享交流不作商业用途，版权归原作者和原作者出处。