新生儿先天性和遗传性疾病筛查与筛查检测技术临床应用
新生儿疾病筛查，是指医疗保健机构在新生儿群体中，用快速、简便、敏感的检验方法，对危及儿童生命、危害儿童生长发育、导致儿童残疾的一些先天性疾病、遗传性疾病进行群体筛检，在患儿尚未出现临床表现，而体内生化、代谢或功能已有变化时做出早期诊断。结合有效治疗，避免患儿重要脏器出现不可逆性损害，保障儿童的体格和智能发育正常。
一、中国新生儿疾病筛查现状
中国新生儿疾病筛查起步于20 世纪80年代，20世纪的90年代中后期进入快速发展阶段，近十年来，随着筛查制度的逐渐规范，筛查技术的不断发展，国民筛查意识的不断提高，中国新生儿疾病筛查日趋成熟。
1.筛查工作制度化：经过多年的探索，我国新生儿疾病筛查经历了从自发开展到有序系统规划的过程，目前新生儿疾病筛查由卫生部统一规划，各省市、自治区卫生厅（局）与妇幼保健处具体实施。
按照《中华人民共和国执业医师法》、《中华人民共和国母婴保健法实施办法》、《中华人民共和国医疗机构管理办法》和《新生儿疾病筛查管理办法》的规定，开展新生儿疾病筛查工作的机构和人员要经过严格审批。
为保障新生儿疾病筛查质量，卫生部于2020年发布《新生儿疾病筛查技术规范（修订版）》，其内容涵盖筛查血片采集技术规范、筛查实验室检测技术规范、PKU和CH诊治技术规范、新生儿疾病筛查追访与管理技术规范[1]。
2.筛查管理信息化：依托于网络信息化技术的发展，目前各省级筛查中心相关信息管理平台陆续上线运行，其中孕产期保健、新生儿疾病筛查、儿童保健等信息基本实现了全省范围内的信息互联互通。各级筛查中心打破地区隔阂，形成紧密的纽带，为新生儿疾病筛查的教育培训、筛查实验室质量管理、筛查阳性病例召回、确诊、早期干预和随访治疗提供了良好的信息化技术支撑[2, 3]。
3.筛查疾病种类多元化：苯丙酮尿症（PKU）和先天性甲状腺功能减低症（CH）是我国最早实现新生儿筛查的两种遗传代谢病，也是目前我国新生儿筛查的主要病种。根据全国妇幼卫生监测办公室和中国出生缺陷监测中心的资料，截至2012年，上海、北京、广州、杭州等大城市的新生儿筛查覆盖率已经达到90%~97%，全国范围内的新生儿筛查覆盖率达77.9%[4]。部分城市或地区根据疾病的发病特点及地区经济技术发展水平，逐渐增加了葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G-6-PD）缺乏症、先天性肾上腺皮质增生症（CAH）、地中海贫血等遗传代谢病的筛查[5-8]。
近年来，新生儿听力筛查在全国范围内迅速发展起来，在很大程度上得力于国家的政策支持和干预。从上个世纪末，国家各部委和机构便相继出台一系列政策明确新生儿听力筛查的意义和实施步骤，如中残联等十个部、局、会文件在1999年（残联康字第222号）便明确“卫生部门贯彻预防为主的工作方针，把新生儿听力筛查纳入妇幼保健的常规检查项目，做到早期发现，早期干预；组织医务工作者、耳鼻咽喉科专家、妇幼保健工作者积极参与有关活动”[9]。至2020年，卫生部组织全国范围新生儿疾病筛查专家，制定了新生儿听力筛查技术规范和技术流程。
4.筛查技术多样化：新生儿筛查起源于欧美等发达国家，1961年美国Guthrie医生成功建立了细菌抑制法对血中苯丙氨酸进行半定量测定，尤其是其创立了干血滤纸片血样采集法，使得苯丙酮尿症（PKU）的新生儿群体筛查得以实现。1973年Dussault等以干血滤纸片为样本，通过放射免疫方法测定出生 4～7 d 的新生儿末梢血中甲状腺素（T4）的含量，筛查先天性甲状腺功能减低症（CH）[10]。
相对于欧美等发达国家而言，我国新生儿疾病筛查开展较晚，但筛查诊断技术发展较快，目前国内在不同疾病的筛查诊断技术中涵盖了荧光分析法（Fluorometry）、时间分辨荧光免疫法（TRFIA）、酶免疫分析法（EIA）、液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）、气相质谱法（GC-MS）、基体辅助激光解吸离子化质谱法（MALDI-TOF-MS）、高通量测序（NGS）等。
二、新生儿疾病筛查的检测技术
1.苯丙酮尿症（PKU）：PKU是一种常染色体隐性遗传性疾病，可引起肝脏苯丙氨酸羟化酶（PAH）缺乏或辅酶—四氢生物蝶呤（BH4）缺乏，导致苯丙氨酸（Phe）不能正常代谢，使血苯丙氨酸浓度增高。BH4 缺乏症中以 BH4合成酶6-丙酮酰四氢蝶呤合成酶（PTPS）缺乏最常见，其次为二氢蝶啶还原酶（DHPR）缺乏。典型 PAH 缺乏性 PKU 临床特点为皮肤白、 头发黄、全身和尿液有特殊鼠臭味、不同程度的智力发育障碍；BH4 缺乏症除上述症状外主要表现肌张力低下。
PKU筛查最早使用的是Guthrie细菌抑制法（BIA），主要原理是枯草杆菌的营养缺陷型芽胞的生长需要苯丙氨酸，样本中苯丙氨酸含量增大时，滤纸片周围的细菌生长环大；反之，生长环小或不生长，环的直径大小与苯丙氨酸的含量成正比。该方法结果直观、好判断、操作比较简便，但试验中引起误差的因素较多, 操作中不仅要控制好温度（过高过低都影响灵敏性），而且还要掌握平皿之间的厚度（过厚过薄都影响菌环的大小），就准确性而言不如荧光分析法好，只能半定量，不能为临床提供一个明确的治疗依据[11]。
目前国内PKU筛查应用最广泛的是荧光分析法，主要原理是苯丙氨酸与茚三酮及铜盐反应生成荧光复合物，或者在苯丙氨酸脱氢酶和NAD+存在下，苯丙氨酸脱氢酶能使NAD+还原成NADH，其产生的荧光强度与苯丙氨酸的浓度成正比。本法可以准确的测定血中的 Phe 含量，并且容易实现自动化，对临床的治疗诊断有较大的意义[11]。
随着液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS）的普及，越来越多筛查机构开始使用该技术进行PKU的筛查，该方法的主要特点是特异性高，通量大，可以同时检测主要代谢物苯丙氨酸和次要代谢物酪氨酸（Tyr），并且计算苯丙氨酸与酪氨酸的比值。从单指标筛查到多指标的过渡，可以提高筛查的灵敏度和检测率，降低假阳性率。血Phe浓度> 120 mmol / L ( > 2 mg / dL)及血Phe与酪氨酸（Tyr）比值（Phe / Tyr） > 2.0 时，统称为高苯丙氨酸血症（HPA）。对所有血 Phe 增高者均需要做串联质谱检测以排除其他病因（如酪氨酸血症、希特林蛋白缺乏症等）引起的继发性血Phe 增高；尿蝶呤谱分析、红细胞DHPR测定或结合BH4 负荷试验可以鉴别PAH缺乏症与BH4缺乏症。基因诊断是PKU及BH4 缺乏症的确诊方法[12]。
2.先天性甲状腺功能减低症（CH）：CH是由于患儿甲状腺先天性缺陷或因母孕期饮食中缺碘所致，前者称散发性甲状腺功能减低症，后者称地方性甲状腺功能减低症，其主要临床表现为体格和智能发育障碍。多数先天性甲状腺功能减退症患儿在出生时并无症状，新生儿期该症状出现的早晚及轻重与甲减的强度和持续时间有关，约有1/3患儿出生后可出现黄疸较重或者黄疸消退延迟、嗜睡、哭声低下、纳呆、前后囟较大、便秘、腹胀、脐疝、心率缓慢、心音低钝等；婴幼儿及儿童期主要表现为特殊面容（眼距宽、塌鼻梁、唇厚舌大、面色 苍黄），身材矮小、智力落后等。
放射免疫法是CH筛查最早使用的方法，主要原理是使放射性物质标记抗原T4和未标记抗原T4与不足量的特异性抗体竞争性地结合，反应后分离并测量放射性而求得未标记抗原T4的量。该方法灵敏度低并且具有放射性污染，已经被逐渐淘汰。
目前CH的筛查主要是通过测定滤纸干血片中促甲状腺激素（TSH）的浓度，绝大多数实验室使用灵敏度较高的时间分辨荧光免疫法（TRFIA）、酶免疫分析法（EIA），大大提高了TSH检测的灵敏度，提高了疾病的检出率。其中以时间分辨荧光免疫法（TRFIA）应用更为广泛，该方法采用独特荧光特性的镧系元素及其螯合剂作为示踪物，采用双抗体夹心法，用镧系元素标记特异性TSH单克隆抗体，检测样品中的TSH的含量。根据镧系元素螯合物的发光特点，用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效地排除非特异荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏度[13]。
仅检测干血滤纸片中的TSH水平，只能用于原发性先天性甲状腺功能减低症的筛查，对于中枢性先天性甲状腺功能减低症，单纯检测 TSH 水平难以发现。传统的干血滤纸片检测筛查，对于TSH 检测结果阳性者需召回进行血FT4复查，用以明确为先天性甲状腺功能减低症还是高TSH 血症。由于中枢性先天性甲状腺功能减低症是由 TSH 分泌减少引起的，故这类先天性甲状腺功能减低症患儿的血 TSH 水平往往无明显升高，甚至可能低于正常值，但是其 FT4水平会显著降低。所以，临床需联合进行 TSH 和 FT4水平检测，以全面筛查原发性和中枢性先天性甲状腺功能减低症。
时间分辨荧光免疫法（TRFIA）可以同时使用铕标记TSH特异性单克隆抗体和钐标记抗原T4，形成TSH和FT4双标记测定试剂盒，一次实验同时联合检测两种标志物，为临床早期诊断新生儿先天性甲状腺功能减低症提供可靠依据，在新生儿先天性甲状腺功能减低症筛查中具有重要的应用价值[14]。
3.葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）缺乏症：G6PD缺乏症是常见的一种Ｘ连锁不完全显性遗传性溶血性疾病，是红细胞酶缺乏所致的溶血性贫血中最常见的类型之一。目前已证实，红细胞G6PD缺乏是引起新生儿黄疸、蚕豆病、伯氨喹啉类药物性溶血、某些感染性疾病所致的溶血和非球形红细胞溶血性贫血的遗传基础。从临床角度而言，该病对人类健康最有威胁的表现是新生儿黄疸导致核黄疸所致的患儿智力低下或死亡。
G6PD的筛查方法包括荧光斑点试验和G6PD活性检测，其原理是在G6PD和NADP+存在下，G6PD能使NADP+还原成NADPH，后者在紫外线照射下会发出荧光。NADPH的吸收峰在波长340nm处，可通过单位时间生成的NADPH的量来测定G6PD活性。该方法操作简单，可直接测定NADPH的量，特异性较好，假阳性率低。基因诊断为G6PD的确诊方法[15]。
4.先天性甲状腺功能减低症（CAH）：CAH是一种由肾上腺皮质激素合成过程中所需酶缺陷引起的常染色体隐性遗传病。按照酶缺陷类型的不同，可分为21-羟化酶缺乏症（21-OHD）、11β-羟化酶缺乏症（11β-OHD）、3β-羟 类 固 醇 脱 氢 酶 缺 乏 症（3β-HSD）、17α-羟化酶缺乏症（17α-OHD）、20,22-碳链酶缺乏症、类固醇激素急性调节蛋白（StAR）缺陷症及 17β-羟类固醇脱氢酶（17β-HSD）缺陷症等。其中21-OHD最常见，约占CAH的90%~95%；11β-OHD次之，占5%~8%；3β-HSD，约占< 1%；其他类型罕见。
CAH筛查主要的方法有酶联免疫吸附测定法（ELISA）、时间分辨荧光免疫法（TRFIA）及液相质谱-串联质谱法（LC-MS/MS）等。新生儿CAH一级筛查常用方法为TRFIA，二级筛查常用方法为LC-MS/MS。
TRFIA是目前国内最常用的CAH筛查方法，其检测原理：采用固相二抗抗原竞争法，固相上带有第二抗体，血片中17α-OHP与示踪物Eu+标记17α-OHP共同竞争第一抗体结合，形成的抗原-抗体复合物，同时被固相第二抗体结合，在微孔表面形成二抗-一抗-抗原-Eu复合物。经洗涤除去剩余Eu+标记17α-OHP，加入增强剂，分离结合在固相上的Eu+，并与其形成强荧光螯合物，然后进行测定，标本中17α-OHP浓度与荧光强度呈反比。
LC-MS/MS的检测原理：用含内标d8-17羟基孕酮（d8-17OHP）和 d2-皮质醇的萃取液将血斑中的 17α-OHP、11-脱氧皮质醇、21-脱氧皮质醇、皮质醇和雄烯二酮洗脱出来，经过高效液相色谱柱进行分离后，进入质谱采用多反应监测模式进行数据采集，完成各个检测物的定量。
初次筛查阳性的新生儿，需进一步确诊。以ELISA、TRFIA作为CAH 一级筛查方法的，确诊时需补充生化检测，并最终进行基因诊断确诊；以LC-MS/MS为一级或二级筛查方法的，若筛查指标已包含类固醇激素，补充生化检测时可不再测同类指标，若筛查指标未包含类固醇激素，则应同时完成生化检测和基因诊断，以进行疾病确诊。基因检测是CAH确诊的金标准[16-18]。
5.地中海贫血：地中海贫血，即珠蛋白生成障碍性贫血，是一组由珠蛋白基因缺失或点突变致使珠蛋白肽链合成部分或完全抑制的遗传性溶血性贫血疾病。临床表现根据病情严重程度不同而有所差异，患者主要以贫血、黄疸、肝脾肿大为突出表现。珠蛋白肽链分为 α、β、γ、δ 四种，而地中海贫血主要有 α、β、δβ、δ 四种类型，以前两种类型（α、β 地中海贫血）最为常见。
地中海贫血筛查主要包括血常规、红细胞形态学检查、红细胞渗透脆性试验、血红蛋白理化性质测定、血红蛋白电泳等检查。目前，常用的地中海贫血筛查流程是通过血常规检查分析平均红细胞体积（MCV）和平均红细胞血红蛋白量（MCH），若 MCV < 80 fl 或 MCH < 27 pg ，则为地中海贫血可疑阳性，对可疑阳性者通过全自动琼脂糖电泳进行血红蛋白定量分析，根据 HbA2 > 4.0 % 或 HbF 异常值可判断为β-地中海贫血；根据 HbH 异常值可判断为中间型α -地中海贫血；若 HbA2 < 2.5%，则高度怀疑为α-地中海贫血基因携带者，可通过珠蛋白肽链聚丙烯酰胺凝胶电泳来明确。基因检测被认为是诊断地中海贫血的金标准[19, 20]。
6.新生儿听力筛查：新生儿听力筛查是早期发现新生儿听力障碍，开展早期诊断和早期干预的有效措施，是减少听力障碍对语言发育和其他神经精神发育的影响，促进儿童健康发展的有力保障。
目前国内用于新生儿听力筛查的方法主要为瞬态声耳声发射（TEOAE）和自动判别听性脑干反应（AABR），筛查流程为：在安静舒适的环境中，新生儿熟睡或喂奶处于安静状态下，应用筛查型耳声发射仪，进行瞬态诱发耳声发射（TEOAE）筛查，由仪器自动判定通过或者不通过，若不通过则需要反复筛查方可确定，初筛于出生后2～3 天、复筛于出生后42天进行，复筛采用筛查型耳声发射仪结合自动判别听性脑干反应（AABR），采用快速自动听性脑干反应测试系统进行，仪器根据内置筛查方案结合二项式算法，对提取的ABR波V 进行分析处理，自动产生“通过”或“不通过”两种结果，复筛未通过者在3个月内进行第二次复筛，第2次复筛仍未通过者应用声导抗、ABR、ASSR进行听力学评估，以 ABR波 V反应阈值> 30dBnHL作为听力损失标准，同时进行跟踪随访[1, 21]。
由于进行新生儿听力筛查只能发现已存在听力障碍的患儿，对于听力正常的遗传因素导致的迟发型耳聋患儿和药物致聋敏感基因携带者则有漏诊的危险。近年来随着分子生物学及遗传学的迅速发展，耳聋的遗传因素越来越被重视，听力及耳聋基因联合筛查作为一种新型筛查模式，目前在临床应用中越来越广泛。
目前耳聋基因检测的方法有基因芯片法、荧光定量PCR法、基体辅助激光解吸离子化质谱法（MALDI-TOF-MS）、高通量测序（NGS）等，其中基体辅助激光解吸离子化质谱法（MALDI-TOF-MS）具有检测位点多、覆盖率高、准确、高通量、低成本、自动化程度高和周期短等特点，能够满足临床对耳聋基因检测的要求，适合大范围、大规模的检测项目。该技术可以同时检测GJB2、SLC26A4、GJB3、 线粒体12SrRNA共4个耳聋基因的20个热点突变位点。检测过程主要分为8个步骤：样品预处理，Pre-PCR（前 PCR）扩增，虾碱性磷酸酶（SAP）处理，延伸反应，阳离子交换树脂纯化，点样仪点样，质谱检测，分析实验结果获得分型数据[21-25]。
7.氨基酸代谢障碍和有机酸血症及脂肪酸氧化代谢障碍等多种遗传代谢病：目前国内采用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）检测新生儿滤纸干血片中数十种氨基酸、游离肉碱及酰基肉碱的水平，筛查50余种氨基酸代谢障碍、有机酸血症及脂肪酸氧化代谢障碍等多种遗传代谢病（表1），真正实现了从“一种实验检测一种疾病”到“一种实验检测多种疾病”的转变，并且能够使假阳性和假阴性的发生率大大降低。随着近年来LC-MS/MS技术在新生儿疾病筛查领域中的推广和应用，使新生儿疾病筛查在内容和质量上都提高了一个新水平[26]。
LC-MS/MS是一种高灵敏度、高特异性的快速分析技术，其原理是将各种被测物质分子电离成各种质荷比M/S不同的带电粒子，应用电磁学原理，使这些带电粒子按照质荷比大小在空间或者时间上产生分离排列成的图谱，通过测定离子峰的强度对分析物进行定量检测或鉴定。
使用LC-MS/MS进行多种遗传代谢病筛查时，需要将滤纸干血片样本进行前处理，可以通过衍生化（酯化，主要是丁基酯）或非衍生（非酯化，游离酸）两种方法来分析，其中非衍生化操作简单、方便且无神经毒性损害而应用越来越广泛。非衍生化法处理步骤：（1）从干血斑标本上打出血斑（3.2 mm），置于96孔板中；（2）等分分配含内标萃取液到每孔，贴上封片以减少蒸发，摇动孵育合适时间，使萃取溶液与血斑相互作用；（3）取出 96 孔板，每孔转移适量萃取液至新的耐热96孔微孔板，铝箔覆盖，以防挥发；（4）将96孔板置于串联质谱仪自动进样器中进行后续分析。检测指标和筛查病种见表1 [27-30]。
三、新生儿疾病筛查的发展趋势
由于遗传代谢病诊断学、治疗学的进展以及社会经济的发展，符合进行新生儿疾病筛查标准的疾病谱不断增加。新生儿疾病筛查也由“一种疾病检测一种标志物”到“一种疾病同时检测分析多种标志物”的转变，及“一项实验检测一种疾病”到“一项实验同时检测多种疾病”的转变。在该转变过程中，液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）在新生儿疾病筛查中展现了巨大的潜力和优势。
LC-MS/MS以色谱实现分离，串联质谱进行检测，具有分离和结构解析同步完成的特点，能快速定量和定性分析复杂生物基质中多种痕量组分。在遗传代谢疾病筛查中，LC-MS/MS 的“标准”配置是LC-ESI串联四极杆质谱。近年来，随着超高效液相色谱（UPLC）和大气压光离子电离（APPI）等多种新技术的不断出现，以及串联质谱仪器（包括四极杆飞行时间质谱、轨道离子阱质谱）的不断更新迭代，LC-MS/MS在分离能力、检测灵敏度及适用范围方面得以进一步改善。可以预见，在今后的研究中，基于串联质谱技术的疾病筛查谱一定会得以扩展。目前国外已有将串联质谱应用于溶酶体贮积症的筛查，诊断以及治疗监测，在诊断速度、样品用量、灵敏性和特异性上均比传统的酶学测定有了很大的提高[31]。
随着新生儿筛查疾病谱的不断增加，对筛查后的疾病诊断也提出了更高的要求。相对于根据代谢物测定浓度进行诊断，代谢物要受疾病状态和环境的影响，而遗传性的基因的改变不受生理状态和环境的影响，而且能检测出家系杂合子携带者，因此基因诊断是遗传代谢病诊断的“金标准”。传统的一代测序技术费时费力，需要为每一个致病基因、每一个突变位点分别建立方法，临床诊断效率很低，不适合临床应用。近年来，新一代测序技术（NGS）在基因诊断领域逐渐发挥了关键作用[32-34]，可同时对数百万个DNA 分子进行大规模的平行测序，例如可建立串联质谱代谢异常基因谱、新生儿代谢病筛查基因谱、溶酶体贮积病基因谱、性发育疾病基因谱、肌张力障碍相关基因谱、脑白质病基因谱、线粒体病基因谱、代谢性骨病基因谱、糖原累积症基因谱等检测，为临床诊断提供依据。
然而，遗传代谢病病种繁多，每个病种涉及的基因数量多，总的突变位点更多，且各病种之间鉴别诊断复杂，仅通过目前的一代和二代（NGS）测序技术费时费力，可能会延误诊断和及时治疗。随着下一代测序技术的快速发展，成本的下降，现有基因变异数据库的扩大，以及对变异理解和解释能力的增强，通过基因组方法进行的新生儿疾病筛查已经成为可能，并成为以后新筛发展的趋势。这将是一非常重要的领域，有非常大的挑战，可与目前的筛查模式形成互补，为疾病的发生、发展及预后提供更详细的筛诊信息和治疗策略，将新生儿疾病筛查继LC-MS/MS后再提高一个新水平。
参考文献略
注：本文来源于《临床实验室》杂志2020年第12期“回顾与发展”专题