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Transcriptional insights into the CD8+ T cell response in mono-HIV and HCV infection

HIV或HCV单独感染中CD8+T细胞免疫应答的转录水平研究

一、研究背景

人类免疫缺陷病毒(HIV)和丙型肝炎病毒(HCV)均属高度易变、复制快速的RNA病毒,能在人体内建立长期慢性致病性感染。在没有接受治疗的情况下,HIV或HCV单独感染者的疾病进程具有显著差异。然而,有一小部分HIV感染患者能维持病情长期稳定,包括长期不进展者(LTNPs)和精英控制者(ECs);少数HCV感染患者可发生自发性病毒清除(称为HCV自发清除者)。由于HIV-HCV合并感染较为常见,了解CD8+T细胞在HIV或HCV单独感染中转录水平上的相似性,有助于提高抗病毒治疗的疗效。因此,作者在疾病不同的进展阶段对HIV或HCV单独感染者的CD8+T细胞基因表达谱进行了荟萃分析及生物信息学分析。

二、分析流程

三、结果解读

1. 筛选差异表达基因(DEGs)

在GEO数据库中获取相关表达谱芯片数据。其中,GSE6740和GSE49954的分组为HIV/HCV慢性感染者vs健康对照者。GSE24081、GSE6740、GSE93711和GSE93712的分组为HIV长期不进展者/HCV自发清除者vs相应慢性感染者(表1)。

表1.相关芯片数据集概览

  • 在HIV/HCV慢性感染组vs健康对照组中,作者使用limma包进行差异表达分析,并以|log2 fold change (FC)|≥1.5 或 P<0.05为筛选条件。在HIV慢性感染组vs健康对照组中,共筛选出625个DEGs(136个上调,489个下调)。在HCV慢性感染组vs健康对照组中,共筛选出154个DEGs(56个上调,98个下调)。图1显示了相应热图。

    图1.HIV/HCV慢性感染组vs健康对照组的DEGs热图

  • 在HIV长期不进展组/HCV自发清除组vs相应慢性感染组中,作者使用表达谱数据分析在线工具INMEX进行差异表达分析,并以Fisher's combined p value<0.10为筛选条件。在HIV长期不进展组vs慢性感染组中,共筛选出92个DEGs(47个上调,45个下调)。在HCV自发清除组vs慢性感染组中,共筛选出50个DEGs(13个上调,37个下调)。

2. GO和KEGG富集分析

作者使用DAVID软件进行GO和KEGG富集分析,以P<0.05作为标准。

  • 在HIV/HCV慢性感染组vs健康对照组中,GO分析显示HIV和HCV的DEGs共同参与了免疫应答、炎症反应、正向调节NF-κB活动等生物过程(图2a、图2b)。KEGG通路富集分析显示,HIV和HCV的上调基因均在NF-κB信号通路、细胞因子和细胞因子受体相互作用信号通路富集(图2c、图2d)

    图2.HIV/HCV慢性感染组vs健康对照组的GO和KEGG分析图

  • 在HIV长期不进展组/HCV自发清除组vs相应慢性感染组中,KEGG通路富集分析显示,HIV和HCV有7个相同通路富集(图3a、图3b)。由于细胞周期与病毒感染期间的CD8+T细胞的功能有关,作者对此进行了GO分析。图3c显示,在HIV长期不进展组vs相应慢性感染组中,7个与有丝分裂密切相关的基因中,2个上调,5个下调。作者认为下调基因数量占优势可能提示了有丝分裂减缓。在HCV自发清除组vs相应慢性感染组中,在有丝分裂进程中起到负向调控转录活动的RBL2上调,提示可能与细胞分裂的抑制有关。同时,与细胞凋亡有关的基因STAT5A、MTCH1下调。综上作者推断HIV长期不进展者/HCV自发清除者的病程得到控制可能与CD8+T细胞存活数的提升有关,这借由有丝分裂细胞周期减缓和细胞凋亡减少实现。

    图3.HIV长期不进展组/HCV自发清除组vs相应慢性感染组的KEGG和GO分析图

3. PPI网络构建

作者利用STRING数据库预测DEGs的相互作用关系(confidence score>0.4),随后利用Cytoscape工具对PPI网络进行可视化。

  • 在HIV/HCV慢性感染组vs健康对照组中,HIV-DEGs的PPI网络中共包含542个节点,根据degree值进行排序仅显示排名前100的节点(图4a)。作者发现degree值排序前100的节点中,多数与干扰素刺激基因(ISGs)的上调有关。HCV-DEGs的PPI网络中共包含92个节点(图4b),degree值排序靠前的CXCL8、TLR2、FPR1均与ISGs的上调有关。图4c的Venn图显示两者间有17个共有DEGs。GO分析显示这17个DEGs主要参与细胞防御反应。

    图4.HIV/HCV慢性感染组vs健康对照组DEGs的PPI网络及Venn图

  • 在HIV长期不进展组/HCV自发清除组vs相应慢性感染组中,HIV-DEGs的PPI网络中(图5a)作者发现其中10个节点与ISGs的下调有关,包括GBP1、MX1、IRF9、EIF2AK2、IFIT3等。HCV-DEGs的PPI网络中(图5b)作者同样发现degree值最高的三个节点与ISGs的下调有关,包括EP300、STAT5A、PPP2CA。

    图5.HIV长期不进展组/HCV自发清除组vs相应慢性感染组DEGs的PPI网络

4. miRNA预测

作者使用mirDIP和miRDB数据库预测可同时作用于HIV和HCV的miRNA。作者选取了HIV长期不进展组vs相应慢性感染组中,与ISGs的下调有关的IFIT3;HCV自发清除组vs相应慢性感染组中同样与ISGs的下调有关的STAT5A,两者均具有较高的degree值。在靶向作用于IFIT3的9个候选miRNA和靶向作用于STAT5A的16个候选miRNA中,作者发现miRNA-143-3p是两者候选miRNA的交集。相关报道显示ERK5是miRNA-143的靶基因,且在原代人内皮细胞和单核细胞中起促炎作用。因此作者推断miRNA-143-3p可能通过抑制ERK5发挥其抗炎作用。在附加材料中,作者通过细胞转染和PCR技术发现miRNA-143-3p的过表达可抑制原代CD8+T细胞ERK5的表达(图6),提示miRNA-143-3p对ERK5具有负向调节作用。

图6.miRNA-143-3p下调ERK5表达

小结

作者挖掘GEO数据库中HIV和HCV相关表达谱芯片数据,分析差异表达基因后,通过DAVID工具进行GO分析和KEGG通路富集分析预测靶基因功能和相关通路,利用STRING平台及Cytoscape软件构建蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络,最终筛选出与疾病进展密切相关的miRNA-143-3p。最后作者提交了补充材料,通过细胞转染和PCR技术发现miRNA-143-3p的过表达可抑制原代CD8+T细胞ERK5的表达,进一步证明miRNA-143-3p对ERK5具有负向调节作用。

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