温故知新系列：『珍藏版』Cell观点 | 深刻反思肠道菌群与人类疾病研究，是时候将微生物组研究拉回正...

2020年1月23日，加拿大University of Alberta的Jens Walter在Cell发表观点文章Establishing or Exaggerating Causality for the Gut Microbiome: Lessons from Human-Microbiota-Associated Rodents，对肠道菌群研究进行了反思。现BioArt将文章编译如下，以供读者思考。

摘要

现今对于肠道菌群的研究可谓如火如荼，越来越多的人类疾病被认为与自身肠道微生物的改变有着千丝万缕的联系，但是，这种改变与发生的疾病之间是因果还是伴随或者干脆就不相关，在很大程度上尚待解决。在之前的研究中，人们试图用人类微生物群相关（Human-microbiota-associated，HMA）啮齿动物中得到的数据来解释宿主病理和微生物种群改变之间的关系。在系统的综述中，我们发现95％的已发表的有关HMA啮齿类动物的研究（36/38）报告了病理表型转移至受体动物的行为，并且许多研究结果就此推断出了对人类疾病与微生物群组改变的因果推论。我们认为这种跨物种的推论是令人难以信服的，并且夸大了肠道微生物组在人类疾病中的作用。在这里我们主张采用更严谨和批判的方法来推断因果关系，以避免错误的概念并防止不切实际的期望，这些期望可能会破坏微生物组科学的信誉并延迟其转化。

微生物组学研究现状

在过去的十年中，有关微生物组的文章迅速增加，仅在2018年就出现了超过一万篇。这些文章将微生物组与各种人类慢性疾病联系，这样微生物组学研究就具有了重大的治疗意义，这引起了科学家的浓厚兴趣。实验动物模型为微生物组在慢性疾病状态中的作用提供了有力的经验证据。但是，这样的因果推论在人类中却比较困难。在某些方面，许多人类疾病与自身粪便微生物群有关，患病个体微生物群在某些方面与健康个体不同，包括分类学成分、多样性指数和/或功能读数的变化。这种与疾病相关的微生物组变化通常被称为“肠道菌群失调”，这个术语在微生物组领域广泛使用，但定义仍然模糊不清，经常被滥用。由于尚未定义“正常”或“健康”的微生物组，因此我们使用术语“肠道菌群失调”仅指与特定疾病或状况相关的微生物组相较于对照发生了变化。在大多数情况下，这种“肠道菌群失调”微生物组是疾病的原因还是后果，还是两者都是由第三因素引起的，都未经证实。如果微生物组要成为干预的有效靶点，则必须进行确认。

建立因果关系的挑战对科学或医学而言并非新鲜事物。将流行病学观察结果从相关性转变为因果关系具有众所周知的局限性，因此在没有对相关疾病机制性洞察的情况下警惕相关性至关重要。在微生物组领域，有两种文献记载，清楚的将微生物标志物与疾病的病因联系起来的案例：幽门螺杆菌相关的消化性溃疡和胃癌和梭状芽胞杆菌（或梭状芽胞杆菌）难治性感染相关的腹泻。然而，复杂的微生物组与其他炎性、代谢性、肿瘤性和神经行为性疾病之间的因果推论既没有说服力也没有结论性。此外，由于微生物群是高度个体化的细菌、古细菌、真菌、病毒和原生动物组成的群落，因此鉴定导致病理的复杂微生物群的病因成分变得很复杂，所有这些微生物群及其代谢物都可能在疾病中起作用，或者单独或一起发挥作用。此外，某些微生物组成分可能会保护或减轻疾病，但是它们的影响可能只是个例，可能不是直接发生的，它们更可能使宿主容易患病。因此，因果关系很少是简单的，而是相当复杂的，多维的，并且是由微生物群落内部的协同相互作用驱动的。

有没有什么有力的实验证据能证明肠道菌群的作用呢？有，肠道菌群移植（FMT）的相关实验可以获得肠道微生物群在人类疾病中起因作用的最具说服力的实验证据。微生物组预防艰难梭菌相关疾病尽管是出色的实验范例，但人类FMT仍然有局限性。首先，出于道德原因，它们只能用于研究微生物组的保护特性。其次，FMT可能无法纠正已经改变的微生物组，特别是在微生物组未受到严重破坏的疾病中。最后，由于需要长期的前瞻性研究，肠道菌群在人类慢性疾病发展中扮演什么角色用FMT来评估也是不切实际的。因此，需要间接的实验模型来建立改变的微生物组与疾病发病机制之间的因果关系。进行这种因果推断的最常用模型是将粪便微生物群落从有或没有疾病或病症的个体移植到无菌的啮齿动物中，然后对受者动物的病理表型进行比较分析。这种模型被称为人类微生物群相关（HMA）啮齿动物。在这里，我们认为使用HMA啮齿类动物提出的因果关系主张的研究比例过高，这是不可信的，并且可能是由于实验设计不够严格，统计分析不适当以及偏见所致。夸大微生物组在疾病中的作用会损害微生物组科学的信誉，并可能延迟其转化。我们尝试将批评转化为建设性的建议和实验指南，以评估动物模型中的因果关系，并提出替代方法检验因果关系。我们提倡改变微生物组科学的思维方式，

即研究应该以其科学的严谨性（即使是阴性的结果）为根据进行评估和发表，而不是一味博人眼球，追求轰动效应。

HMA鼠模型：优点突出，缺点明显

HMA鼠模型用于回答各种科学问题。首先，它们可以确定人类微生物群是否可以在啮齿动物疾病模型中诱发病症并建立潜在机制，以及表型是否受到环境因素（例如饮食）的影响。其次，它们可用于建立改变的微生物组与人类宿主的疾病或其他病理或生理状况之间的因果关系。后一种应用是最常用的，已应用于多种病理生理状态，例如肥胖症哮喘、过敏症、炎症性肠病（IBD）、结直肠癌、帕金森氏病、抑郁症、营养不良和自闭症。此外，HMA鼠模型代表了一个平台，可以使用集成的“组学”方法来识别导致疾病的致病微生物以及引起疾病的机制变化的微生物组的因果成分。

尽管在确立微生物组改变与人类自身疾病的因果关系中HMA鼠是金标准和基石，它们在此应用中还是存在着明显的局限性。有一个无法回避的问题就是人类肠道微生物组的很大一部分类群无法在受体动物中定殖；能够定殖的类群也会形成区别于人类供体的群落。最重要的是，移植后的HMA鼠并没有导致人生病的生态因素（例如饮食，生活方式，疾病表型和人类基因型），使得与疾病相关的改变难以重现。而且定殖过后的类群可能不参与它们与原生宿主建立的宿主微生物相互作用。例如，HMA小鼠在免疫，肠道和大脑成熟方面存在缺陷，并且与宿主的代谢相互关系也有所不同。细菌致病性研究证明了跨越宿主物种的困难。幽门螺杆菌和艰难梭菌是人类微生物组中在人类疾病中已建立因果关系的两个成员，它们中的两个均未表现出足够的定殖性以引起常规鼠模型的发病。这样的例子还有很多，空肠弯曲杆菌，伤寒沙门氏菌，伤寒沙门氏菌，霍乱弧菌，志贺氏菌和苍白密螺旋体等人类病原体均无法在小鼠中很好地定殖或复现人样疾病。综上所述，虽然HMA小鼠模型在概念上对疾病因果的研究很有吸引力，但单一人类致病微生物无法在小鼠身上复制其病状也缺乏相应的环境限制，这让人怀疑整个微生物群是否能做到这一点。

HMA小鼠模型的实验设计

HMA 啮齿动物模型始终有效！那阴性结果去哪儿了？

通过系统性的文献综述，我们评估了建立或暗示HMA鼠模型与改变的人类微生物群与疾病或病理状况之间因果关系研究的“成功”率。在38项符合纳入标准的研究中，除两项（36/38；95％）外，所有研究均得出结论，与健康供体相比，出现类似于人患病症状的患病供体粪便移植到无菌小鼠后会导致更严重的疾病。剩下的两个例外都研究了人类微生物组在大肠癌中的致病性，得出的结论是，受体小鼠的疾病与供体的疾病状态无关，而是取决于小鼠模型的基线微生物组或人类结肠粘膜的微生物组成。

值得注意的是，系统评价中的研究涵盖了广泛的致病过程：炎性、过敏、肿瘤、退化、代谢、和由遗传和环境等多因素引起进行性慢性疾病。考虑到这种复杂性以及人类微生物群中大多数报道的“不良生物模式”并非特定于某种疾病状态的事实，因此微生物组的改变很可能是继发于疾病，因此微生物组的因果主张似乎在所有疾病状态下不可信。这促使人们质疑HMA鼠模型中类人疾病的科学标准是否足够严格。

在这些研究中只有少数研究（34％；13/38）确定了潜在的将不良微生物组与疾病联系起来的机制。举个例子说，在定殖有对牛奶过敏的婴儿的微生物群的无菌小鼠回肠中，基因Fbp1、Tgfbr3和Ror2被下调。而带有厌食杆菌的无菌小鼠的单菌落上调了这些基因，并且保护了小鼠免于过敏反应。这样的研究尽管有时候超出了研究者的可用资源范围，但是仍然值得花力气去做，因为这对于微生物组学领域的发展至关重要。

HMA啮齿动物是一个相对较新的模型，并且实验设计尚未标准化。通常，每个人类疾病和对照组使用少量（1-5）人供体，然后将这些“供体微生物组”复制到大量单独的小鼠中，然后将其用于统计推断。这样的实验设计和分析由于几个原因而令人怀疑。首先，大多数研究中使用的少量捐赠者并未捕获到人类肠道微生物组的广泛个体间差异，该差异通常远大于疾病引起的效应量。这种变化的很大一部分（> 80％）不能归因于已知因素，其中很大一部分可能是由随机的生态过程引起的。因此，即使微生物组差异是造成人类疾病的原因，样本量太少也不足以让我们下结论。大多数已发表的有关HMA啮齿类动物的研究缺乏严格的实验设计和统计分析，因为它们使用的供体数量不足并且遭受“假复制”。值得注意的是，令人鼓舞的是，最近的一些研究使用HMA啮齿动物已应用了适当的统计数据。

尽管实验设计和统计分析中的缺陷都有可能导致我们的系统评价中阳性研究的代表性偏高，但实际上对阳性结果的贡献却没有那么明显，有别的因素对此贡献却更大。偏见出现在各个层面，但是最大的因素是，要使研究在主要期刊上发表，结果必须是正面的，负面的发现很少在这些期刊上发表。这一点可能是几乎所有科研工作者心中的痛。当几乎所有报告都是正面的时候，产生的怀疑就会越大，而审查的理由就越合理。为什么这很重要？自我校正可能是科学上最强大的方面，但是只有在发表负面发现时它才能起作用。微生物组科学的临床转化需要确认宿主与微生物之间的因果关系以及确定其贡献机制。具体来说，是对改变的微生物群的校正。通过FMT，仅当微生物组学变化是疾病的因果、起因时，活生物疗法或微生物产品才是有益的。

确定肠道微生物组在疾病病因学中的因果作用的其他实验方法

测试因果关系时如何提高实验严谨性？

HMA啮齿动物是研究因果关系和宿主-微生物相互作用机制的有力模型，我们在这里并不反对它们的使用。它们特别适合研究代谢宿主-微生物组的相互作用，但是为了测试与人类疾病相关的微生物组变化的因果作用，HMA动物实验设计必须可靠。我们已经扩展了先前的建议，即如何设计，分析和解释HMA模型，并在方框中总结了我们的建议。方法和标准可能会继续发展，我们鼓励其他人提出替代方案、或其他指南和策略来改善这些概述的建议，这些建议将作为讨论如何评估微生物群落因果关系的起点。该领域将从专家协会的指南中受益，该指南定义了使用HMA动物进行实验所需的最少信息。这一领域也需要足够的经费去做一些关键性实验。

接受在啮齿动物身上实验作为在人类疾病中起作用的证据的标准需要更严格、精确的审查，并且最好与可能的分子机制相关。鉴于因果推理和机制的重要性，进HMA研究标准的改进可能有助于解决已为微生物组领域确定的问题，如“积极研究”偏见、炒作、缺乏审查、术语、定义等。改善HMA模型的其他策略也值得考虑。鉴于啮齿动物和人类的相似性有限，通过免疫或代谢方式“人源化”（例如，通过植入人类免疫或代谢细胞）的啮齿动物将增加检测特定于人类的宿主微生物相互作用的可能性。另外，像猪和灵长类这样的更能模仿人类生理的实验宿主，假如成本下降的话也会成为很好的实验模型。为了建立测试人类微生物组研究中因果关系的框架，人们对科赫的假设进行了修订，并提出了实验程序以验证从微生物组的基因组分析中得出的假设。这些框架利用了在确定因果关系方面的最新突破，即通过利用多组学数据集的研究方法进行研究。尽管这些模型功能强大，但它们也遭受了HMA啮齿动物的某些相同限制，但如果在更合适的接收宿主中使用，则这些偏移可能会抵消。

鉴于从动物推断人类发现的局限性，已经出现了直接在人类中建立因果关系的方法。孟德尔随机化和中介分析等新颖的统计方法已被用于人类研究中肠道微生物组代谢物与宿主标志物之间的因果推断，以及数学和机器微生物组数据可采用因果分子网络，结构方程模型或贝叶斯网络推断等学习方法。诸如调解分析之类的策略受益于纵向数据，在纵向数据中，变量的时间顺序可以帮助解开因果关系，因为这种影响不能在时间上先于原因。然而，这些方法所需要的统计假设是否能够对微生物群落做出可靠的因果推断，必须首先建立和验证。

改变观念和政策

微生物组科学显然会从更加严格和更多批判中受益，但是与所有科学一样，在其他方面也需要改变才能实现其光明前景。早就应该改变对科学研究价值和标准的激励机制和判断标准。人们已经提出了与科学所有领域相关的纠正措施的详细清单，但是由于发表偏见导致的夸大其词似乎在微生物组在人类疾病中的因果作用研究中更成问题。一些科学杂志已经发布了一些“负面问题”，但更可取的是将态度转变为根据其科学优点而不是缺乏轰动效应来判断负面发现。半个多世纪前，卡尔·波普尔（Karl Popper）建议严谨的研究应该尝试拒绝它的假设；“对理论的每一次真正的检验都是一次尝试证伪它，或反驳它”。可悲的是,大多数研究人员、微生物组领域的评论家以及几乎所有的高影响因子期刊编辑，似乎认为接受零假设是失败的一件事。正如所有的科学努力一样，我们的领域如果更高层次期刊的编辑政策更好以及资助机构的指导方针不去鼓励任何针对阴性数据、重复、实验验证设计和统计分析的歧视，那我们领域发展的春天才会来临。由于科研人员在这些期刊上的成功在很大程度上决定了他们的科学生涯和研究经费，因此期刊政策的变化可能具有变革性的意义。

结论

钟摆向两个方向摆动。曾经有一段时间，知识界不太接受幽门螺旋杆菌是导致人类各种复杂疾病的原因。但是现在，似乎有人一厢情愿地认为，无论病因多么复杂，大多数疾病和病理过程都与微生物组有关。是时候将微生物组研究拉回正轨了，我们要回归到更批判性和更严谨的科学方法上，特别是当使用HMA啮齿动物作为其建立因果关系的基础模型时更应该注意这一点。这么做无疑将会让这一激动人心的领域在人类健康方面应用的光明前景得到保障。

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.cell.2019.12.025