11分长文综述解析乳腺癌异质性研究

异质性转录调控：从发育到癌症的“幕后黑手”

　　乳腺是由不同类型的细胞亚群组成的，这些细胞具有不同的表型，此即所谓“异质性”（heterogeneity）。

　　对于这些乳腺细胞亚群的分类及分子特性研究，为我们深入了解其不同的转录程序和调控机制提供了更加广泛的思路。

　　在乳腺癌研究中，这些信息成为研究乳腺癌细胞异质性的基础。

　　多年来，对于乳腺癌形成过程的研究指出，大多数乳腺癌在发生之前都经历了复杂的“进化”过程，其中有诸多转录调控因素扮演了“幕后黑手”的角色。

　　在去年1月份发表于The EMBO Journal上的一篇题为“Transcriptional regulation of normal human mammary cell heterogeneity and its perturbation in breast cancer”的综述中，作者概述了正常人类乳腺细胞异质性中发生的转录调控及其在乳腺癌中的影响，对现有技术的不足提出了警告，对未来研究的发展进行了展望。

　　为了清晰了解全文结构的概况，笔者将全文分成三个部分，可以参考上面的思维导图。下面将分别对其中的主要内容进行概述：

　　1 乳腺的基本结构

　　乳腺是一个连续的导管分支树（branching tree of ducts），从乳头（nipple）向外呈放射状延伸，终止于腺泡（alveolar）结构，通常我们称其为小叶（lobules）。

　　这样的结构被包裹在基底膜和外层的成纤维细胞中，所有这些成纤维细胞都被嵌入含有脂肪细胞（adipocytes）、巨噬细胞（macrophages）、淋巴细胞（lymphocytes）、血管和淋巴管的胶原基质中。

　　乳腺本身是由两层具有不同特征和功能的细胞组成。

　　外“基底”层（basal）是由直接与基底膜接触的细胞构成，这些细胞也被称为肌上皮细胞，因为它们具有可收缩的、平滑肌样的特性。

　　腺体的内“管腔”层（luminal）包含了完全不同的、极化的上皮细胞特征，具有在激素诱导下产生和分泌乳汁的能力。

　　2 人类乳腺细胞的亚型分类

　　在早期的乳腺发育研究中，我们大多使用小鼠模型开展。

　　随后，技术的发展使我们的研究对象转变成为单个的活细胞，这种技术允许我们对这些构成乳腺组织的不同细胞类型的生物学和分子特征进行进一步的研究。

　　以CD49f和EpCAM为分子标志物，我们可以将乳腺细胞分为目前广泛接受的三个亚群——基底细胞（basal cells，BCs）、管腔祖细胞（luminal progenitors，LPs）和管腔细胞（luminal cells，LCs）。

　　BCs的特征是CD49f+ EpCAMlow，同时它们也表达大量的其他标志物，例如KRT14，TP63、ACTA2/SMA、MME/CD10和THY1/CD90。

　　这些分子标志物可以在组织水平上区分BCs和LPs、LCs。

　　LPs和LCs的共同特征是高表达EpCAM，同时也表达其他与管腔层相关的组织学标志物，如KRT8，KRT18，MUC1。

　　这两种EpCAMhigh的乳腺细胞还可以根据其表达的CD49f（或CD117，c-KIT）的差异进行细分。

　　LCs是EpCAMhigh CD49f-的细胞，它们大多数高表达雌激素受体（estrogen receptor，ER）和孕激素受体（progesterone receptor，PR），低表达甚至不表达EGFR。

　　LPs是EpCAMhigh CD49f+，这表明它们可能处于BCs和LCs过渡之间的一个中间阶段，它们中只有少数表达ER和PR。

　　此外，LPs还具有以下3个特点：

　　（1）大多数LPs具有非常短的端粒，并表现出明显的端粒相关的DNA损伤反应，即使是在20多岁女性的乳腺细胞中也是如此；

　　（2）一些表达活化的caspase-3的LPs在体外仍表现出显著的增殖活性；

　　（3）LPs天生对氧化应激具有更强的抵抗力，并具有更高水平的相关DNA损伤。

　　最近几年新出现的单细胞测序和RNA-seq实验也进一步支持了以上对于乳腺细胞亚型的分类方式。

　　但作者提出，由于我们无法在人类身上进行谱系追踪实验，这必然会限制我们对人类乳腺细胞功能和分子特性的了解。

　　因此，对于永生细胞系和基于小鼠模型的研究不能等同于对人类原代乳腺细胞的研究。

　　此外，流式细胞术和克隆分析在效率和特异性上都存在技术局限性。

　　3 人类乳腺细胞中的转录调控

　　转录调控是基因表达中极其重要的一环。

　　从调控方式的角度我们可以大致将其分为表观调控和基因组调控两个层面，作者也从这两个层面对乳腺细胞中的转录调控进行了概述。

　　在表观调控的水平上，已有研究报道了甲基化，如H3K27me3，在luminal和basal细胞中基因表达差异的影响。

　　这些基因包括许多编码转录调控因子和/或其他乳腺发育中具有重要作用的通路成员。

　　随后的分析显示，DNA甲基化是外显子和内含子使用的一个稳定标记，并有证据表明内含子保留事件对于每个亚群是特异的，并与蛋白质表达的差异相关。

　　之后的研究也在LPs和LCs中找到很多比在BCs中多的去甲基化的增强子元件，这些元件与FOXA1，GATA3和ZNF217的结合相关。

　　此外，还有研究表明来源于正常人类乳腺细胞的表观基因组和转录谱与已建立的非致瘤性永久乳腺细胞系有很大差异。

　　这表明依赖于用这些细胞系来源的数据来推断控制正常人类乳腺细胞生物学特性的机制的存在缺陷，从而再次强调了分析原代细胞的重要性。

　　在基因组调控方面，可以分为顺式调控和反式调控，上面说到的DNA或组蛋白甲基化能够通过影响增强子或启动子影响基因表达就是一种顺式调控。

　　在反式调控中，最重要的一类调控因子便是转录因子（transcription factors，TFs），对于原代人类乳腺细胞表观基因组和转录组谱的分析也鉴定出很多亚群特异性的TFs。

　　在BCs中通过直接作用调控小鼠乳腺干细胞活性的TFs之一是ΔNp63，它是一个已知的在多种上皮组织中维持正常干细胞存在的调控因子。

　　ΔNp63似乎调控多条关键通路，包括通过上调Fzd7表达增强WNT活性，激活Hedgehog信号以及部分程度上阻碍Notch信号的效应。

　　BCs中TP63的表达在怀孕和哺乳期间也是必要的，在表达K14的成年小鼠细胞中基因缺失Trp63会导致LCs增殖和分化的缺陷，也会因为缺少BCs中EGF家族配体NRG1的表达而不能产奶，这在LCs中ERBB4/STAT5A激活也是必要的。

　　TFs还被发现参与luminal细胞的产生和维持。

　　其中，GATA3被发现在控制小鼠胚胎、青春期和成年期乳腺的形态发生方面具有重要作用。此外，GATA3可能通过与ESR1形成一个正调控环，促进小鼠管腔内细胞的分化。

　　FOXA1与激素诱导的乳腺导管侵入（invasion）有关，但不影响小叶腺泡成熟和产乳。

　　ELF5在妊娠期间对腺泡发育有重要作用，其缺失导致基底/腔内分子表型混合的细胞积累。

　　ELF5通过下调SNAI2的转录来抑制EMT。在LPs中ELF5还直接影响STAT5的表达，也是另外一个参与腺泡生成的TF。

　　与RUNX2的作用相反，RUNX1通过调节ELF5和FOXA1的表达，至少部分地诱导ER+管腔细胞的出现，可能是p38α激酶的下游。

　　4 人类乳腺癌的细胞与分子异质性

　　乳腺癌起源于经历了连续进化的子代细胞产生异常克隆的单个细胞，可以由子代细胞中分布的遗传和表观遗传变化来划分。

　　与正常乳腺细胞相同，乳腺癌细胞也可以根据它们的范围和局限或不局限于包围着正常乳腺组织，恶性细胞的增殖活性和核异常的基底膜，以及它们的ER、PR和HER2的表达进行分类。

　　全基因组测序已经鉴别出5个主要的亚型，分别是basal-like，luminal A，luminal B，normal-like和claudin-low。

　　同样，根据基因组测序结果和表观基因组标志的变化可以对这些亚型进行了进一步细分。

　　有趣的是，5种主要的肿瘤亚型的表达谱与BCs，LPs和LCs的表达谱有相关性。

　　一般的，从转录谱来看，basal-like乳腺癌细胞与LPs最相近，luminal A/B细胞与LCs最相近，claudin-low癌症细胞与BCs最相近。

　　5 人类乳腺癌细胞中的转录调控

　　乳腺癌的“drivers”常常被用来指那些反复被发现的，对细胞恶性特征有贡献的突变。

　　相反“passenger mutations”通常用来形容那些似乎在基因上和恶性细胞进展无关的突变。

　　值得注意的是，大多数最常见的突变会直接或间接地影响与转录调控相关的基因。

　　从反式调控角度来看，GATA3是一个经常变化的转录调控因子，通常出现在ER+的乳腺癌中。

　　临床和实验证据表明，GATA3的突变与乳腺癌的发生和发展直接相关。

　　GATA3的表达与预后良好有关，但这一定仍存在争议。

　　在小鼠和细胞系研究中，GATA3高表达可减少肿瘤发生、抑制转移并促进luminal分子信号的表达，而GATA3的缺失可加速肿瘤的进展。

　　此外，在大于15%的乳腺癌中，MYC是高扩增数的。

　　这通常与不好的临床预后相关，表现在ER-的乳腺癌表型中。

　　MYC是一个已经被研究的很深入的原癌基因。

　　特别值得注意的是，有证据表明，在人类乳腺细胞系中，MYC的过表达会引发表观基因组的重新编程，从而赋予肿瘤启动的特性，并下调luminal特异性的TFs和基因。

　　还有研究表明MYC的活性受与它结合的EPIC1（一个LncRNA）影响，它在很多肿瘤中高表达。

　　在诸多研究中表现出一个有趣的规律，MYC扩增数的增高在原代人类乳腺细胞转化株和射线诱导的乳腺细胞系中是一个高频事件。

　　6 对目前研究局限性的思考

　　在使用的研究模型方面，作者提出小鼠乳腺癌模型中的肿瘤很容易产生，且它们也常常缺乏人类乳腺癌的遗传复杂性。

　　它们与人类乳腺癌的相似之处又往往局限于所产生肿瘤的特定部位。

　　此外，它们的病理表现可能高度依赖于用来驱动致瘤基因表达的启动子，很少表现出高侵袭性。

　　小鼠基因的表达谱也与人类不同，一些人类乳腺癌的表型不可能在小鼠中模拟。

　　例如，虽然ER+肿瘤占人类乳腺癌的绝大部分，但稳定的ER+小鼠乳腺肿瘤很难获得，导致小鼠肿瘤ER表达的基因改变往往不是患者ER+肿瘤的特征。

　　细胞模型的研究也存在局限性，这一点在上文中已有叙述。

　　例如来源于正常人类乳腺细胞的表观基因组和转录谱与已建立的非致瘤性永久乳腺细胞系有很大差异。

　　因此，作者认为把从正常组织中分离出的原代细胞作为乳腺癌从头发生的实验模型是最好的。

　　这种模型避免了物种间差异，避免了通过人类永生细胞系进行推论的局限性。

　　综上所述，异质性是乳腺癌基因组和表观基因组的显著特征。

　　这些特征可能解释了这些恶性细胞群体的转录组中相应的不同表现。

　　由于这些变化以及控制正常人类乳腺细胞特性的分子网络的不完整，我们仍然不能找打产生乳腺癌的关键初始转化事件。

　　但对初始转化事件的研究仍然是开发有效控制癌症发展的重要潜在目标。  

　　随着稳定转染方法和新的筛选方法的出现，我们可以延伸出很多更准确的模型。

　　这些模型与新型的研究技术相结合，为我们未来更快速地识别对乳腺癌发展至关重要的靶机制带来了新的希望。

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