F0代小鼠基因型鉴定的步骤

F0代小鼠基因型鉴定的步骤：

待小鼠成长至5—7天，剪取小鼠脚趾，放入1.5ml洁净离心管中；

加300μl裂解液（预先加入胰蛋白酶），离心使小鼠脚趾沉淀至管底；

55℃放置5 hours,使之充分消化，然后取出短暂离心；

加入等体积酚氯仿，混合均匀，12,000rpm离心5min；

吸出上清并丢弃，加入等体积三氯甲烷，轻轻混合均匀，并于4℃,12,000rpm离心10min；

吸尽上清，加2.5倍体积的无水乙醇和0.1倍体积的NaAC（3M，PH=5.2），-20℃放置30min；

取出后在4℃,12,000rpm离心5min，观察管底是否有白色沉淀产生。同时除去液体，室温静置使乙醇充分干燥挥发，最后用灭菌纯水进行溶解，测定溶度；

以提取的小鼠基因组为模板，用预先设计的鉴定引物进行PCR反应，扩增带有突变位点的DNA条带；

使用PCR仪进行DNA片段退火处理，设置程序如下：

95℃    5min

95℃    30 s ,  -1℃/ Cycle     x60 cycles

25℃    3min

16℃    ∞

在退火后的DNA片段中加入T7E1酶，37℃酶切30—60min，1%琼脂糖凝胶进行电泳，如有多条带产生（Wild Type DNA片段没有）则该小鼠目的基因有突变；

将T7E1酶切鉴定的阳性结果小鼠DNA扩增片段连接至T载体中，转化涂板后挑取4—8个克隆，并进行测序，从而确定F0代小鼠具体基因突变信息。

T7E1酶切体系