【衡道】不同细胞量蜡块的样本制备方法
细胞诊断学在病理具有不可或缺的价值。此篇文献编译是相关样本制备方法的一个小集成。
藉由制作适当高质量细胞蜡块获得足够的细胞样本，不仅能够进行细胞学诊断，还能用来进行更多的辅助性研究，如免疫组织化学染色，原位荧光杂交和其他分子研究等，帮助对病变进行明确分类与确定治疗方案。
与传统手术获得的样本相比，细胞技术所需费用相对低廉，且侵入性较小。细胞蜡块可以永久储存，同时允许保留原始涂片。另外一个好处是，新兴微波处理技术可应用于小型活体组织和细胞蜡块，进而缩短紧急样本的制备时间，提高报告时效。
Varghese等人在现代病理学杂志上发表了一项验证研究，分析比对了细胞蜡块与外科手术蜡块染色形态的免疫组织化学结果。该研究使用了41个样本并附加适当对照，共比对了113个染色项目的118次染色，结果表明一致率为95.7％。
对于从细胞蜡块中获得的组织与来自相应手术样本的组织，实验室可以使用不同的细胞块制备方法，从所谓「穷人的方法」的低技术蒸汽固定方法到高科技的Cellient自动化细胞蜡块制作系统等。本文描述了几种细胞蜡块的制备方法。
需要说明的是：
1、当实验室决策采用哪种方法时，必须统筹考虑制备和工作流程及实验室资源、样本量、样本类型等。
2、不同的细胞蜡块制备使用不同的培养基来冲洗、运输和固定样本。中性缓冲福尔马林被认为是普遍的固定剂。其他固定剂包括福尔马林/ 95％乙醇冲洗液液和Nathan酒精福尔马林替代品（9份100％乙醇/ 1份40％甲醛），被认为是一种毒性较小固定剂。甲醇则作为自动Cellient细胞蜡块技术固定剂。许多辅助测试平台使用福尔马林固定石蜡包埋的组织进行验证。
3、由于抗原性改变，非福尔马林固定方法可能出现假阴性免疫细胞化学染色结果，实验室需要对使用酒精和福尔马林固定的细胞蜡块进行免疫细胞化学和分子技术验证。
凝块和刮擦方法：
可以藉由细针抽吸方式吸取样本置于载玻片上以获得细胞蜡块。此方式易使样品干燥/凝结; 将材料从载玻片上刮下并用拭镜纸包裹，置于包埋盒中，加入中性缓冲福尔马林后于病理学实验室进行组织处理。
02
BBC细胞块固定方法
使用细针抽取1 ml BBC细胞蜡块固定液冲洗非涂层试管样品，将试管倒置在适当的滤纸上，待流体排出后，将纸张刮掉一个小区域。然后于组织病理学实验室中进行常规样本处理。
03
血浆凝血酶细胞块制备
这是最常用的细胞蜡块制作方法。通过添加离心细胞悬浮沉淀物制备细胞蜡块。将细胞物质浸入血浆和凝血酶凝块中（图1）。将20ml样品加入到falcon管中，并以1650rpm离心10分钟。离心后，去除上清液。沉淀物中加入0.5ml血浆和两滴3％曙红水溶液并振荡混合。接下来，添加0.25-0.5ml重新组成的凝血酶，并快速搅拌溶液，凝块将在30-60秒内形成。将凝块置于含有福尔马林的包埋盒中。然后在组织病理学实验室中进行常规处理样本。
图1. 血浆凝血酶细胞块制备
04
火棉胶袋细胞蜡块制作程序
该方法将适当细胞液在火棉胶袋中进行更充分的细胞蜡块制备（图2和3）。
火棉胶袋管的制备：将适量火胶棉试剂倒入15毫升玻璃管，让火棉胶在管中放置10-15分钟，将火棉胶倒回试剂瓶中，倾倒时振荡管子，将试管倒置在试管架中，使其保持约30分钟直至干燥。干燥后，用蒸馏水填充管子。如果袋子不够干燥，管子看起来不透明，袋子即不能使用，应该丢弃，在使用前去除蒸馏水。火棉胶袋可存放长达一周。
火棉胶袋中细胞蜡块的制备：使用分注器将样本移到火棉布袋中。将火棉胶袋试管2500rpm离心10分钟。小心吸去上清液。使用镊子，将胶棉袋的边缘装配在管子的唇缘。使用镊子将袋子从管子中取出，然后在颗粒上方系上棉线，用剪刀剪掉多余的胶棉袋和绳子，将剩余的袋子放入组织包埋盒中，并将包埋盒子放入装有10％中性缓冲福尔马林的样品杯中，进行组织病理实验室常规处理样本。
图2. 火棉胶袋细胞蜡块制作
图3. 火棉胶袋细胞蜡块制作
05
Shandon Cytoblock方法
该技术是藉由手动制备细胞蜡块产品，使用带有包埋盒和试剂的试剂盒，将包埋盒置于中性缓冲福尔马林中进行组织病理实验室常规样本处理，通过细胞离心机浓缩细胞而制成。
该技术取代了耗时且昂贵的琼脂和凝血酶技术，并且需要无磷固定剂，例如Zinc Formal-Fixx，Formal-Fixx或Glyo-Fixx（福尔马林替代品），或省略马林固定步骤在处理机上处理的样本。也可以在快速活检程序上操作。
06
Cellient自动细胞块系统
该技术通常使用于小的组织碎片及液基抹片时，它是第一个全自动细胞蜡块制造系统（图4）。将60ml样品置于小瓶中以2400rpm离心5分钟，将样品旋转离心后，倒出上清液。只需将三滴细胞沉淀物添加到PreservCyt样品瓶中固定，将含有样品的小瓶放入Cellient自动化细胞蜡块系统即可制成。平均作业时间为45分钟。
图4. Cellient自动细胞块系统
07
HistoGel方法
该技术优先用于单独散布的细胞学样本，该方案包括浓缩细胞步骤且轻易切取细胞蜡块表面。该技术可常用于宫颈ThinPreps细胞蜡块制备，且易取得分散的异常个体细胞。
将样品以3000rpm离心5分钟，倒出上清液，沉淀物留在管中，HistoGel（HG）通过在微波以中等功率熔化5至15秒而液化，足够的HG来覆盖沉积物（约0.5ml）并与沉淀物混合使HG固化（室温下2到3分钟或使用冷却块时更快），由管壁加入10％中性福尔马林剂将固化的HG沉淀物从管底部移出，并置于包埋盒的滤纸中进行组织病理学实验室常规处理样本，切取石蜡块时应小心，因组织碎片可能正好在蜡块表面。
08
组织凝固物凝块法
该方法在细针抽吸针尖端的内腔形成凝块。然后将凝块直接转移到福尔马林中进行固定，这样可防止诊断样本丢失。使用组织凝块法制备细胞蜡块，利用21号/ 22号抽血空针，抽取样本，而不是使用注射器将材料排到盐水中制备蜡块。
当样本离开针尖时，将其收集到预切片的滤纸上，针尖以圆周运动方式引导形成锥形组织和血液混合物凝结。将凝块在滤纸上稍微风干，确保凝固物是固体且细胞元素不会分散在液体介质。
将样品包裹在薄纸中并放入包埋盒子和福尔马林容器中，然后在组织病理实验室中进行常规样本处理。
09
福尔马林或酒精蒸气法
使用福尔马林或酒精烟雾固定样本。该方法不需要额外的设备和试剂，材料是从细针抽吸中排出，在通用样本容器内部形成小凝块，翻转盖子，将一张薄纸球推入容器底部，将约2ml福尔马林加入容器中并浸入薄纸中。如果使用酒精，则将两个异丙醇拭子放置容器的底部。
将容器置于室温并倒置至少6小时，这时样品已经被福尔马林或酒精蒸气固定并变成固体，加入福尔马林将其盖子取下以打破样本和盖子之间的吸力。样本放入包埋盒中，一旦从盖子上取下，就需加入福尔马林，然后在组织病理实验室中进行常规样本处理。
10
用于细胞颗粒或组织碎片的细胞块技术—方法1
（使用百分比95酒精）。这种常用的方法使用酒精离心样品，该样本已预先固定于酒精溶液中。
将50 mL的患者样品倒入标记的试管中，存放等分（如有必要）进行辅助测试，用固定剂（95％酒精）或溶解剂（例如CytoLyt）样本持续离心10分钟（2500转/分钟）。倒出上清液彻底震荡涡旋样本（确定是否需要）。
第二次离心以溶解血液量多或硬化/致密细胞颗粒样本。添加等分试样95％酒精与样本，调匀再次离心。完全倒出酒精。此时，根据细胞颗粒的大小，择最合适的方法。如果是细胞蜡块颗粒非常小和/或沉积物很少或不能很好地包埋，则使用替代技术，如HistoGel或琼脂。使用刮刀从锥形管中取出细胞沉淀，宽度须适当，放入组织包埋盒中，于组织包埋盒底部放入海绵，固化良好的细胞颗粒物没有必要使用太大的海绵。
将适当大小的拭镜纸放在蓝色的海绵上，将细胞蜡块置于拭镜纸上，以包埋盒为中心，取第二张拭镜纸以45度角放置在细胞蜡块的顶部，再于第二张拭镜纸顶部放置第二块海绵，中间有一个孔，牢固地将包埋盒卡入到位，并将包埋盒放入福尔马林中，然后在组织病理实验室中进行常规样本处理。
图5. 用于细胞颗粒或组织碎片的细胞块技术 - 方法1
11
用于细胞颗粒或组织碎片的细胞块技术—方法2
（使用生理盐水，RPMI或福尔马林收集）。通常此法用于细胞蜡块制备（图5和6）。将样本转移到50mL锥形离心管中并作好标记，将离心机设置为2400rpm运行5分钟以获得浓缩的细胞，倒出上清液，达成浓缩细胞成按钮状。样本可能没有粘性，除去上清液会开始下降，如果发生这种情形可添加缓冲福尔马林以帮助修复。该混合物应静置30-60分钟以使其凝固，然后用刮刀去除按钮状样本，直到脱离管子。
将按钮状样本放在用中性缓冲福尔马林湿润的组织薄纸上面，并放入组织包埋盒中。完成所有步骤后，将包埋盒及其内容物放入缓冲的福尔马林中使其完全覆盖包埋盒。让样本固定至少30分钟或更长时间，然后在病理实验室进行样品处理。如果细胞非常小和/或沉积物很少，不能很好地包装，请使用替代技术，例如HistoGel或琼脂。对于大的，固化良好的细胞沉淀，可能不需要海绵。
图 6. 用于细胞颗粒或组织碎片的细胞块技术 - 方法2
相关推荐：
了解更多衡道病理资讯，欢迎访问官网：https://www.histomed.com