新加麻黄附子细辛汤是治疗肺癌的一个好方剂
新加麻黄附子细辛汤是治疗肺癌的一个好方剂
----新加麻黄附子细辛汤对小鼠Lewis原位肺癌的治疗作用
姚静静,杜振华,李自波,杜钢军河南大学药学院 药物研究所
摘 要: 〔目的〕观察新加麻黄附子细辛汤对小鼠 Lewis 原位肺癌是否有治疗作用。〔方法〕Lewis 肺癌细胞滴气管建立小鼠 Lewis 原位肺癌模型,次日用新加麻黄附子细辛汤(麻黄∶细辛∶附子∶半夏 = 1∶ 2∶2∶ 5) 灌胃开始治疗, 观察各组小鼠的生存状态、肿瘤数目及致瘤率;HE 染色法观察肺病理变化。〔结果〕用 Lewis 肺癌细胞滴气管建立的 Lewis 原位肺癌模型 8 周后致瘤率为 91% ,肿瘤数目平均为 17 ± 3. 05;新加麻黄附子细辛汤在相同时间内致瘤率为 69% ,肿瘤数目平均为 12 ± 1. 53。HE 染色结果表明:正常组小鼠肺部切片未见癌细胞;模型组小鼠肺组织间聚集有片状核大深染的肿瘤细胞,出现明显癌变,细胞核与细胞质比例失常,细胞核密集, 空洞逐渐变小;新加麻黄附子细辛汤组细胞核密集区相对较少。与模型组比较,新加麻黄附子细辛汤组体质量明显上升, 摄水食量增加, 自主活动增多, 精神状态良好。〔结论〕新加麻黄附子细辛汤能够延长 Lewis 原位肺癌模型小鼠的生存时间,对小鼠 Lewis 原位肺癌具有治疗作用。
肺癌是一种严重威胁人类健康和生命的疾病,其临床表现复杂,难以早期发现,对其综合治疗的机会变小[1] 。 随着中医药的不断发展,越来越多的中药可以用于抗肿瘤治疗,改善症状,提高肿瘤患者生存质量。中医中药作为肺癌的辅助治疗,是目前临床肺癌治疗中不可或缺的重要部分[2] 。
目前,在肺癌的动物实验中大多使用小鼠皮下种植肺癌细胞系,在皮下形成肺癌肿瘤结节的动物模型,如孙秋艳等[3] 用体外培养的 Lewis细胞悬液注射于小鼠左侧腋下,形成皮下肿瘤。这种肺癌模型成瘤率高,基本可以达到 100% ,并且周期短,适合肿瘤的活性筛选和评价。但是, 皮下接种瘤脱离了原位微环境的影响,往往和临床实际情况不符[4]。为了保证动物模型和临床结果的一致性,本实验拟采用 Lewis肺癌细胞滴气管,建立小鼠 Lewis原位肺癌模型,观察新加麻黄附子细辛汤对肺癌的治疗作用。
1 材料与仪器
1. 1 实验细胞 小鼠 Lewis 肺癌细胞( LLC), 购于中科院上海细胞库。
1. 2 实验动物昆明小鼠,雄性,由河南省医学实验动物中心提供。
1. 3 药品及试剂 新加麻黄附子细辛汤制备方法:分别称取原药材麻黄 10 g、细辛20 g、附子20 g、半夏50 g(即按照1∶ 2∶ 2∶ 5 进行组方),混合后自来水冲洗干净,加水量没过药面,浸泡30min,中火煎煮,时间30min,取水煎液。重复上述过程,共煎煮 3 次。合并 3 次滤液加热浓缩至 400mL,使水煎液浓度为10 g/kg。
试剂 包 括:体积分数为10% 的胎牛血清、DMEM 培养基、质量分数 0. 25% 的胰酶(美国Hyclone 公司产品)、生理盐水、戊巴比妥钠、PBS 缓冲液、苏木精、盐酸酒精、伊红。
1. 4 实验仪器CO2 细胞培养箱(赛默飞世尔科技有限公司);HDL 超净工作台( 北京东联哈尔仪器制造有限公司);高速冷冻离心机(北京京立离心机有限公司);电子天平(上海精密科学仪器有限公司);电子体温计(泰克曼电子仪器有限公司);YSL-1A多功能小鼠自主活动记录仪(淮北正华生物仪器设备有限公司);KD202C转轮式切片机( 浙江金华科迪仪器设备有限公司)。
2 实验方法
2. 1 细胞培养 将小鼠 Lewis肺癌细胞置于含体积分数 10% 的胎牛血清及 DMEM 完全培养液中, 在 37 ℃、体积分数为 5 % 的 CO2培养箱中培养,2 ~ 3 d 更换 1 次培养液,质量分数为 0. 25% 的胰蛋白酶消化传代。待细胞达到所需量时,显微镜下计数,调至所需要浓度。
2. 2 造模 先以 0. 2 mL(约 1 × 106个细胞)接种于昆明小鼠腋下,20 d 后以颈椎脱臼法处死荷瘤小鼠,体积分数为 75% 的酒精浸泡消毒,无菌条件下剥离肿瘤组织,剪碎后用预冷的无菌生理盐水洗净,用组织研磨器研碎,制成瘤细胞悬液,1 000r /min,5 min,离心 2 次,加入生理盐水调整细胞浓度为 5 ×106 个/mL。体积分数 0. 5% 的戊巴比妥钠溶液, 按 0. 1 mL /10 g 体质量剂量对昆明小鼠进行腹腔注射麻醉,取上述瘤细胞悬液10 μL 滴入昆明小鼠气管中。
2. 3 分组及给药 造模后将 36 只昆明种雄鼠随机分为 3 组, 每组12 只,分别为:新加麻黄附子细辛汤组(即复方组)、模型组、正常组。复方组及模型组次日开始给药, 复方组以 10 g/kg 灌胃给药,2 次/d;模型组以 0. 2 mL /10 g 蒸馏水灌胃,2 次/d。正常组按正常方式饲养。
2. 4 检测指标及方法 实验开始后各组动物每周记录体质量、水食量、自主活动等变化情况,以此对比小鼠的活跃程度。实验结束后,小鼠摘眼球取血,颈椎脱臼法处死小鼠,解剖分离得到肺组织,计算小鼠肺组织表面的肿瘤数目及致瘤率。
2. 5 病理检测 小鼠处死后, 取各组小鼠肺组织用体积分数为4% 的多聚甲醛固定, 常规石蜡包埋、切片、HE 染色、乙醇脱水、透明、封片,显微镜下观察肺组织病理学变化。
2. 6 统计学分析采用 SPSS18. 0 统计软件分析处理,实验数据以x珋± s 表示,采用单因素方差分析和 t 检验,P <0.05 表示有统计学意义。
3 实验结果
3. 1 对小鼠体质量变化的影响 正常组小鼠体质量明显增加,模型组小鼠体质量呈逐渐减轻的趋势小鼠状态明显下降,复方组小鼠体质量相对平稳。图 1。
3. 3 对小鼠自主活动的影响各组小鼠的自由活动次数随着试验时间的增长而逐渐减少,复方组小鼠的自由活动次数虽有所下降,但是仍然较模型组高。说明复方组小鼠比模型组精神状态好,具有显著性差异。见图 4。
3. 4 新加麻黄附子细辛汤对小鼠 Lewis原位肺癌肿瘤数目和致瘤率的影响
图 5 可见,正常组肺组织鲜红;Lewis 原位肺癌模型组有明显的肺损伤,肿瘤区域较多;复方组肺组织表面比模型组肿瘤数减少。
用 Lewis 肺癌细胞滴气管建立的 Lewis原位肺癌模型 8 周后肿瘤数目平均为 17 ±3. 05, 致瘤率为91% ;而复方组在相同时间内肿瘤数目为 12 ±1. 53,致瘤率为 69% ,具有显著性差异 (P <0.05 )。
表明新加麻黄附子细辛汤对小鼠 Lewis原位肺癌具有治疗作用。
3. 5 病理学检测结果
将各组小鼠的肺组织切片进行 HE 染色,在显微镜下观察到:正常组小鼠肺部切片未见癌细胞, 结构排列整齐;模型组小鼠肺组织间聚集有片状核大深染的肿瘤细胞,出现明显癌变,出现核裂解现象,细胞核大而清楚,核仁增大,细胞核与细胞质比例失常,细胞核密集,空洞逐渐变小;复方组细胞核明显小于模型组,有少量的肿瘤细胞进入,说明新加麻黄附子细辛汤能明显改善 Lewis肺癌模型肺组织的病理变化。结果见图 6。
4 讨论
中药复方在抗肿瘤方面发挥着日益重要的作用,而肺癌作为最主要和最常见的肿瘤,许多复方已在其治疗或辅助治疗过程中体现出了很大的应用价值[5] 。
寒邪是六淫邪气之一, 与肿瘤的发病机制关系密切[6]。《伤寒论》中记载麻黄附子细辛汤, 方中麻黄解表发汗,除太阳表之寒邪;制附子扶阳温里暖少阴之里;细辛温经通阳,入里佐附子温经通少阴,助阳散里寒,出外助麻黄发汗温经解表散寒,具有扶正解表、散寒止痛的功效[7] 。虽然麻黄附子细辛汤有较强的散寒作用,但化痰作用偏弱。为了增强化痰作用, 在麻黄附子细辛汤基础上增加半夏,半夏具有燥湿化痰的功效,和肺癌的发病机制相吻合,诸药合用对肺癌具有良好的治疗作用。
本研究通过麻黄细辛附子汤加半夏组成的新加麻黄附子细辛汤来研究其水煎液对小鼠 Lewis原位肺癌的治疗作用。研究表明,模型组小鼠的肿瘤数目和致瘤率明显比新加麻黄附子细辛汤多,具有显著性差异。在生存状态方面, 与正常组相比, 模型组小鼠体质量下降,食欲欠佳,饮水、饮食量减少, 精神状态不好,活动减少。复方组比模型组体质量明显上升,摄水食量有所增加,精神状态良好。HE 染色结果表明,新加麻黄附子细辛汤组肺组织间肿瘤细胞明显比模型组少。
综上所述, 用 Lewis 肺癌细胞滴气管建立小鼠Lewis原位肺癌模型,具有较好的成瘤率及转移特性。
新加麻黄附子细辛汤是治疗肺癌的一个好方剂。
参考文献:[1] Bugiantella W, CavazzoniE, Graziosi L, et al. Small bowelmetastasisfrom lung cancer: a possible cause of acute abdomen. Case report andliterature review[J] . G Chir,2011,32(3): 120 - 122.
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[3] 孙秋艳, 刘艳, 汪茜, 等.绿原酸对 Lewis 肺癌小鼠及人A549 肺癌的实验研究[J] .华西药学杂志,2010,25(5):536 - 538.
[4] 李宁,张晓晔,蒋中秀,等.小鼠 Lewis 肺癌原位模型的建立[J] .中国实验动物学报,2014,22(5):79 - 83.
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[6] 赵令竹, 鞠宝兆.寒邪与肿瘤关系探要[J] .中国医药导报,2015,12(25):104 - 106.
[7] 邓玉艳,伍德军.麻黄附子细辛汤治疗肺癌疼痛 30 例[J] .河南中医,2012,32(10):1279 - 1280.