转录组讲师带你读文献(3)-CYP46A1是GBM中的一个候选抑癌基因
我在我在04-转录组笔记推文任务列表（半年期）里面安排了6个经典综述和10篇转录组应用文献给大家，可惜愿意沉下心了认真苦学的并不多。（https://share.mubu.com/doc/14uneHKvPg）
所以安排转录组讲师给大家做一下领读：
Date：2020-08-07 Author：张娟
1 文章信息
Title：Therapeutic implications of altered cholesterol homeostasis mediated by loss of CYP46A1 in human glioblastoma
标题：人类胶质母细胞瘤中CYP46A1缺失介导的胆固醇稳态改变的治疗意义
作者：Rolf Bjerkvig2,8 , Xingang Li1& Jian Wang1,2（通讯）
单位：1 山东省脑功能重构重点实验室，齐鲁医院神经外科，脑科学研究所；
2 卑尔根大学生物医学系 ；
8 卢森堡卫生研究所，肿瘤系，诺勒克斯神经肿瘤实验室
发表时间和杂志：28 November 2019，EMBO Molecular Medicine（IF8.821）
摘要
胆固醇代谢紊乱是许多癌症的标志，包括胶质母细胞瘤(GBM)，但它在疾病进展中的作用尚不清楚。在这里，我们鉴定了胆固醇24-羟化酶(CYP46A1)，一种脑特异性酶，负责通过将胆固醇转化为24羟化胆固醇(24OHC)消除胆固醇，是GBM中最显著的胆固醇代谢异常基因之一。
与正常脑组织相比，GBM标本中CYP46A1明显降低。在人类胶质瘤中，CYP46A1表达的减少与肿瘤分级的增加和预后不良有关。异位表达CYP46A1通过增加24OHC水平抑制细胞增殖和体内肿瘤生长。RNA-seq显示，用24OHC处理GBM细胞可以通过调节LXR和SREBP信号通路抑制肿瘤生长。能穿透血脑屏障的CYP46A1激活剂依非韦伦（Efavirenz）抑制体内GBM的生长。
我们的研究结果表明，CYP46A1是GBM中细胞胆固醇的重要调节因子，而CYP46A1/ 24ohc轴是一个潜在的治疗靶点。
Keywords 24OHC; cholesterol homeostasis; CYP46A1; efavirenz; glioblastoma
2 数据与方法
RNA-Seq测序：GBM#P3 cells经过24OHC和DMSO进行72小时处理，提取total RNA，进行全基因组转录组分析。
差异表达分析：|log2(FC)| > 1 and FDR < 0.01
功能富集：DAVID (https://david.ncifcrf.gov/) ，GSEA分析
数据：GSE54047，GSE46016，GSE46014
3 结果
3.1 胆固醇水平促进GBM细胞生长
Rembrandt data 数据集包括 217个GBM和28个正常脑组织，GSEA分析显示，胆固醇合成与正常脑组织表型正相关，与之前的研究结果一致：GBM细胞主要依赖正常人星形胶质细胞合成的外源性胆固醇生长。
并且，作者还是用实验进行了证明，使用细胞系，加入胆固醇的细胞增长速度明显比不加胆固醇得快很多。
3.2 CYP46A1是GBM中的一个候选抑癌基因
在Rembrandt dataset数据集合中与胆固醇代谢相关的176个基因进行差异表达分析。脑特异性胆固醇调节因子CYP46A1在GBM中表达差异最大，表达下降(log2倍变化= 2.335，调整后P = 5.85E-25)。
转录组的标准分析，比较容易复现，基本上看我六年前的表达芯片的公共数据库挖掘系列推文即可；
解读GEO数据存放规律及下载，一文就够 解读SRA数据库规律一文就够 从GEO数据库下载得到表达矩阵 一文就够 GSEA分析一文就够（单机版+R语言版） 根据分组信息做差异分析- 这个一文不够的 差异分析得到的结果注释一文就够
此外，基于中国胶质瘤基因组图谱(CGGA)数据集的差异分析还显示，CYP46A1是GBM (n = 128)和正常大脑(n = 5)中最失调的转录本之一(log2倍变化= 1.966，调整后P = 4.63 -09)。
图1A 有13个差异表达的基因的热图；图1B为差异表达分析结果的火山图。单因素方差分析显示，与预后相关的top3基因为APOBR，CELA3A and CYP46A1，**CYP46A1排第三（使用pvalue进行排序）**。
TCGA的数据进行pan-cancer分析，包括31中不同的癌型，结果表明，与GBM和LGG相比，CYP46A1在正常脑内表达明显升高。
通过分析几个公开的胶质瘤数据，进一步证实了GBM中CYP46A1的缺失。
在GBM内部的表达情况：
单细胞数据支持：单细胞RNA-seq数据(Darmanis等，2017)进一步表明，CYP46A1主要表达于神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞前体细胞(OPCs)中，在肿瘤细胞中表达程度较低 IVY GBM RNA-seq data数据支持：与其他肿瘤区域相比，CYP46A1在肿瘤leading edge (主要由正常脑细胞组成)高表达
蛋白水平：在GBM中低表达。结果如下图。来源于IHC data from the Human Protein Atlas 也表明CTP46A1蛋白水平在GBM中低表达。
图1C：Representative images of IHC staining for CYP46A1 protein in normal brain and different pathological grades of gliomas (n = 64). Scale bar = 30 lm图1D：Quantification of CYP46A1 IHC staining in normal brain (n = 6) and different pathological grades of gliomas (n = 58)
随后，我们根据2016年世卫组织对胶质瘤的分类，利用TCGA数据评估了CYP46A1水平。结果如下图。
探讨GBMs中CYP46A1降低的原因，进行了一系列分析，结果表明：异常组蛋白修饰可能是GBM中CYP46A1表达降低的部分原因。
3.3 在胶质瘤患者中，CYP46A1水平的降低与较差的生存期有关
使用the CGGA dataset 的数据进行CYP46A1基因的临床因素分析。结果表明，高水平的CYP46A1 mRNA水平(基于中值)显示了更好的总生存(OS)和无进展生存(PFS)(图1H和I)。在TCGA和CGGA 的数据中也得到了验证。并且，通过单因素和多因素分析证明CYP46A1是一个独立的预后因子。
3.4 CYP46A1的表达可抑制GBM的生长
接下来，我们研究了CYP46A1在体外GBM生长中的作用。通过各种实验数据证明CYP46A1过表达抑制肿瘤生长。
3.5 24OHC通过减少胆固醇的积累来抑制GBM细胞的生长
已经证明，神经元和星形胶质细胞都产生氧甾醇，包括24OHC，作为大脑胆固醇代谢的结果。这些分子作为内源性配体作用的肝脏X受体(LXRs)，以降低过量的细胞胆固醇水平。在体外培养的GBM细胞中，24OHC处理可显著降低细胞内总胆固醇水平(P < 0.01，图4A)和反映游离胆固醇水平的filipin染色。这些结果表明24OHC通过消耗细胞内胆固醇抑制GBM细胞生长。
3.6 24OHC抑制GBM的生长和GSC的维持
CYP46A1基因编码一种细胞色素P450氧化酶，即甾醇24-羟化酶，其主要功能是将胆固醇转化为24OHC(图3A)。因此，我们对人GBM 24OHC的代谢变化进行了表征。经过一系列的数据实验分析证明，总之，这些数据表明24OHC特异性地抑制GBM的生长。
3.7 24OHC通过调控LXR和SREBP1的活性抑制GBM的生长
为了确定24OHC抑制GBM生长的机制，我们对24OHC处理或不处理的gbm# P3细胞进行了RNA测序(RNA-seq) (heatmap图5A)。GO分析显示，差异表达基因与脂质贮存负调控、胆固醇外排正调控、胆固醇稳态调节和细胞凋亡等生物学过程密切相关。
GSEA显示24OHC与胆固醇外排的正调控相关，而与胆固醇稳态、SREBP靶点和干细胞增殖相关的基因标记负相关。
这些结果表明24OHC不仅可以通过激活LXR，还可以通过其他机制杀灭GBM细胞。根据RNA-seq数据，24OHC也被发现抑制SREBP信号。这些结果表明，抑制胆固醇导致细胞生长24OHC降低的部分原因是LXR靶基因上调和SREBP1活性下调。
3.8 依非韦伦抑制GBM生长，延长颅内肿瘤小鼠的生存
基于CYP46A1通过将胆固醇转化为24OHC抑制GBM生长的发现，我们研究了efavirenz (EFV)的作用(图6A)， efavirenz是一种抗hiv药物，已知可以通过结合酶的变结构位点激活CYP46A1的活性。又是经过一系列实验，综上所述，这些发现表明EFV代表了一种有前途的治疗GBM的药物再利用策略。
4 个人总结
这篇文章可以称得上是单基因研究机制的典范了吧。各种实验，各种公开数据的支持，转录水平，甲基化水平，甚至是蛋白水平和后面IC50的实验，以及到最后通路机制的挖掘，具体到某一个药物的重新利用，都挖的挺深入且详细。
文章整个结论精华图：
看了一眼作者列表，虽然都是中国人，但是其科研单位是：
卑尔根大学，位于挪威第二大城市卑尔根，是挪威人引以自豪的高等学府之一，它创建于1946年，为世界大学联盟和欧洲著名大学联盟科英布拉集团成员之一，是在1825年建立的卑尔根博物馆的基础上发展起来的。