细胞凋亡技术实验详细步骤
一、实验目的
1、掌屋凋亡细胞的形态特征
2、学会用荧光探针对细胞进行双标记来检测正常活细胞、凋亡细胞和坏死细胞的方法
二、实验原理
细胞死亡根据其性质、起源及生物学意义区分为凋亡和坏死两种不同类型。凋亡普遍存在于生命界，在生物个体和生存中起着非常重要的作用。它是细胞在一定生理条件下一系列顺序发生事件的组合，是细胞遵循一定规律自己结束生命的自主控制过程。细胞凋亡具有可鉴别的形态学和生物化学特征。
在形态上可见凋亡细胞与周围细胞脱离接触，细胞变园，细胞膜向内皱缩、胞浆浓缩、内质网扩张、细胞核固缩破裂呈团块状或新月状分布、内质网和细胞膜进一步融合将细胞分成多个完整包裹的凋亡小体，凋亡小体最后被吞噬细胞吞噬消化。在凋亡过程中细胞内容物并不释放到细胞外，不会影响其它细胞，因而不引起炎症反应。
在生物化学上，多数细胞凋亡的过程中，内源性核酸内切酶活化，活性增加。核 DNA 随机地在核小体的连接部位被酶切断，降解为 180-200bp 或它的整倍数的各种片断。如果对核 DNA 进行琼脂糖电泳，可显示以 180-200bp 为基数的 DNA ladder（梯状带纹）的特征。
相比之下，坏死是细胞处于剧烈损伤条件下发生的细胞死亡。细胞在坏死早期即丧失质膜完整性，各种细胞器膨胀，进而质膜崩解释放出其中的内容物，引起炎症反应，坏死过程中细胞核 DNA 虽也降解，但由于存在各种长度不等的 DNA 片断，不能形成梯状带纹，而呈弥散状。
一些温和的损伤刺激及一些抗肿瘤药物可诱导细胞凋亡，通常这些因素在诱导凋亡的同时，也可产生细胞坏死，这取决于损伤的剧烈程度和细胞本身对刺激的敏感程度。
三尖杉酯碱（HT）是我国自行研制的一种对急性粒细胞白血病，急性单核白血病等有良好疗效的抗肿瘤药物。研究表明 HT 在 0.02~5μg/ml 范围内作用 2 小时，即可诱导 HL-60 细胞凋亡，并表现出典型的凋亡特征。本实验用 1μg/ml HT 在体外诱导培养的 HL-60 细胞发生凋亡，同时也有少数细胞发生坏死。用 Hoechst33342 和碘化丙啶（propidium iodide，PI）对细胞进行双重染色，可以区别凋亡、坏死及正常细胞。
细胞膜是一选择性的生物膜，一般的生物染料如 PI 等不能穿过质膜。当细胞坏死时，质膜不完整，PI 就进入细胞内部，它可嵌入到 DNA 或 RNA 中，使坏死细胞着色，凋亡细胞和活细胞不着色。而一些活细胞染料由于为亲脂性物质，可跨膜进入活细胞，因而可进行活细胞染色。Hoechst33342 是一种活性荧光染料且毒性较弱，它是双苯并咪唑的一种衍生物。与 DNA 特异结合（主要结合于 A-T）碱基区），显示凋亡细胞和活细胞。凡是看到有凋亡小体的细胞都是凋亡细胞。
三、实验用品
1、试剂：三尖杉酯碱（HT），300μg/ml，100mmol/L Tris-HCl（pH7.5），5mol/L EDTA 缓冲液、碱性裂解液：0.2mol/L NaOH, 1%SDS、醋酸钠：3mol/L KAc（pH4.8）；异丙醇；70% 乙醇；溴酚蓝，蔗糖指示剂。TBE 电泳缓冲液，1% 琼脂糖，溴乙锭。PI 母液：500μg/ml；Ho33342 母液：2mmol/L。
2、仪器设备：荧光显微镜，电泳仪，电泳槽，微量加样器（1ml，100μl）0.5、1.5ml 离心管，载玻片，盖玻片。
四、实验材料
人早幼粒白血病 HL-60 细胞，用含 10% 小牛血清的 RPMI1640 培养基在 37℃，5%CO2 条件下培养。
五、方法步骤
实验步骤：
两块6孔板，细胞密度：1X105/孔(加样时30%-50%，收细胞时70%-80%)，细胞计数种板，种板时加2 mL培养基。
加材料组作用4h，光照，孵育时间（>10h）。
单染组（PI/FITC）中加入30 μL H2O2 (由市售30% H2O2 10 μL加到 1mL PBS中配制)，处理1-2 h。
1h之后先处理①号板-实验组。
（所有孔一起消化处理）将培养基取出于对应4 mL EP管中，加1 mL PBS, 轻轻洗一次，也收集到4 mL EP管中，再加入 1mL 无EDTA胰酶消化，去掉胰酶，加1mL DMEM（+）终止消化，吹打均匀，将细胞收集到4 mL EP管中，再用1mL PBS洗残留细胞，收集到4 mL EP管中。
处理②号板，先处理FITC/PI单染H2O2处理组，不用加胰酶直接吹下来。
Control组(不染)（消化之后先不离心）、FITC/PI双染组，去掉上清，PBS洗一次，丢弃上清，加无EDTA胰酶，加1mL DMEM(+) 吹散, 消化不要过度，可残留一部分细胞，保证消化下来的细胞都是好的。
全部EP管离心1500 rpm, 5 min, 去掉上清（一定要去除干净，防止培养基对染色的干扰），加400 μL 1X Binding Buffer分散，过滤细胞。开机。加入5 μL Annexin V-FITC，轻轻混匀于冰上避光孵育10 min之后，加入10 μL PI后轻轻混匀于冰上避光孵育5 min，测试。
整个操作过程尽量要快（<1 h）
无EDTA胰酶配制 (0.25%)：
胰蛋白酶0.125g
PBS 50 mL
0.22 μm滤头过滤，分装到1.5 mL EP管，每个1 mL, 保存到-20℃。
六、注意事项
如果有细菌或真菌污染，会严重影响检测效果。
染色后宜尽快检测，时间过长可能会导致凋亡或坏死细胞的数量增加。
如果细胞收集过程中使用了胰酶，需注意设法去除残留的胰酶。残留的胰酶会消化并降解Annexin V-FITC，最终导致染色失败。
荧光物质均易发生淬灭，在进行荧光观察时，尽量缩短观察时间，同时在操作和存放过程中也尽量注意避光保存。