一种中药水蛭提取物的制备方法
专利名称：一种中药水蛭提取物的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种水蛭提取物的制备方法。
背景技术：
水蛭始载于《神农本草经》，是经典的破血逐瘀类中药，以干燥全体入药，别名马鳖、肉钻子、蚂蟥、马蜞、吸血虫、红蛭、水麻贴、沙塔干等。水蛭种类复杂，全世界有300多种，我国分布有60多种。古代医书中记载有利用蚂蟥治疗多种疾病，谓其“主逐恶血、瘀血、月闭、破血消积聚……”。医圣张仲景用其祛邪扶正，治疗“瘀血”、“水结”之症，显示了其独特的疗效。后世张锡纯赞此药“存瘀血而不伤新血，纯系水之精华生成，于气分丝毫无损，而血瘀默然于无形，真良药也”。中国药典收载的水蛭(Hirudo)为水蛭科动物蚂蟥 Whitmania pigra Whitman、水輕 Hirudo nipponica Whitman 或柳叶蚂蟥 Whitmaniaacranulata Whitman的干燥全体。夏、秋二季捕捉,用沸水烫死,晒干或低温干燥。分布于东北、山东、江苏、安徽、浙江、江西、湖北、湖南等地。具有破血通经，逐瘀消癥之功效。用于血瘀经闭,癥瘕痞块,中风偏瘫,跌扑损伤。水蛭中抗凝血活性成分主要为蛋白质、多肽及游离氨基酸类。其中，以水蛭素(hirudin)的研究最为透彻,它是由Mark Wardt于1955年最先从新鲜水蛭的唾液腺中分离得到并加以确定的，是一种由66个氨基酸残基组成的单链多肽，是目前已知作用最强的凝血酶特异性抑制剂。水蛭素呈酸性，溶于水、生理盐水及吡啶中，几不溶于醇、丙酮及苯，遇热或在稀酸中均易变质。干燥药材中水蛭素已被破坏。
此外尚含NLP-I (new leechprotein-1)、蚂蟥多肽、肝素(heparin),抗血栓素(antithromfin)等。传统中药水蛭以干燥全体入药，基本不含水蛭素，但同样也检测到了抗凝活性，这说明水蛭中所含的抗凝血成分不一定只存在于新鲜唾液中，而应该是体内本身所含有的。现代研究表明，传统中药水蛭的药理活性成分主要为多肽和氨基酸类，其药理作用主要表现为
(1)抗凝作用；
(2)抗血栓作用；
(3)脑缺血再灌注损伤保护作用；
(4)血管内皮功能损伤保护作用等。因此，以水蛭多肽和/或氨基酸作为主要活性成分的水蛭提取物具有极大的临床应用价值和市场开发价值。但是，活性多肽不耐热，且对化学试剂敏感，导致不同提取方法或不同炮制品生物活性偏差较大。寻求一种最大限度地保留水蛭多肽生物活性的提取分离方法，以水蛭多肽和/或氨基酸提取物为主要成分制成具有抗凝、抗血栓作用的药物，已经成为一个热门的研究方向。目前，中药水蛭临床应用多以原粉、水煎煮、水煎醇沉、有机溶剂提取等方法。原粉入药异味较重，临床服用顺从性较差，并且吸收效果较差；水煎煮、水煎醇沉、有机溶剂提取等方法，由于加热或化学试剂处理，导致水蛭活性成分的生物活性破坏较大。而酶解法生理活性较强，但并不适用于工业化生产。
发明内容
本发明是要解决现有方法制备的中药水蛭提取物中水蛭活性成分的生物活性破坏较大的问题，而提出的一种中药水蛭提取物的制备方法。本发明的一种中药水蛭提取物的制备方法，是按以下步骤进行的一、取干水蛭研磨成粉末，加入4 10倍重量的纯化水，室温下搅拌浸溃12 24h，在转速为IOOOOrpm的条件下进行离心，取上清液；二、采用分子量截留为50KDa IOOKDa超滤膜对步骤一中的上清液进行超滤处理，收集滤过液A ;三、采用分子量截留为IKDa 5KDa超滤膜对滤过液A进行超滤处理，分别收集截留液和滤过液B，其中截留液作为提取物I ;取滤过液B，过树脂柱，收集水洗液；四、对水洗液进行减压浓缩，然后冷却至4 5°C，再加入4 5°C的乙醇至含醇量达70 80%，然后搅拌均匀，静置10 13h，过滤，收集上清液；五、对上 清液进行低温减压浓缩，得提取物II，将提取物I和II按生药量I : I混合得提取物III，将上述提取物
I、II、III进行冷冻干燥，即得中药水蛭提取物。本发明在室温条件下，采用水浸溃进行提取中药水蛭中活性成分，采用分子量截留分别为50KDa IOOKDa和IKDa 5KDa的超滤膜进行超滤处理，收集分子量在IKDa IOOKDa之间的多肽类，在不破坏多肽类活性的条件下对多肽进行了有效提取、分离和浓缩，避免了常规处理方法中加热或有机试剂对多肽活性的破坏。对于分离得到的分子量小于IKDa 5KDa的游离氨基酸等小分子物质，采用树脂吸附法以及低温70 80%乙醇沉淀法去除杂质，得到纯度相对较高的小分子提取物。其中，多肽类提取物(提取物I)中多肽含量> 90% ;小分子提取物(提取物II)中多肽含量> 30%，游离氨基酸类含量> 20%，糖类含量> 25% ;混合提取物(提取物III)中多肽含量> 55%，游离氨基酸类含量> 12%,糖类含量> 17%。经药效学筛选证实，本发明制备的提取物I、II、III均具有明显的抗凝、抗血栓活性。
具体实施例方式具体实施方式
一本实施方式的一种中药水蛭提取物的制备方法，是按以下步骤进行的一、取干水蛭研磨成粉末，加入4 10倍重量的纯化水，室温下搅拌浸溃12 24h，在转速为IOOOOrpm的条件下进行离心，取上清液；二、采用分子量截留为50KDa IOOKDa超滤膜对步骤一中的上清液进行超滤处理，收集滤过液A ;三、采用分子量截留为IKDa 5KDa超滤膜对滤过液A进行超滤处理，分别收集截留液和滤过液B，其中截留液作为提取物I ;取滤过液B，过树脂柱，收集水洗液；四、对水洗液进行减压浓缩，然后冷却至4 5°C，再加入4 5°C的乙醇至含醇量达70 80%，然后搅拌均匀，静置10 13h，过滤，收集上清液；五、对上清液进行低温减压浓缩，得提取物II，将提取物I和II按生药量I : I混合得提取物III，将上述提取物I、II、III进行冷冻干燥，即得中药水蛭提取物。本实施方式在室温条件下，采用水浸溃进行提取中药水蛭中活性成分，采用分子量截留分别为50KDa IOOKDa和IKDa 5KDa的超滤膜进行超滤处理，收集分子量在IKDa IOOKDa之间的多肽类，在不破坏多肽类活性的条件下对多肽进行了有效提取、分离和浓缩，避免了常规处理方法中加热或有机试剂对多肽活性的破坏。对于分离得到的分子量小于IKDa 5KDa的游离氨基酸等小分子物质，采用树脂吸附法以及低温80%乙醇沉淀法去除杂质，得到纯度相对较高的小分子提取物。其中，多肽类提取物(提取物I)中多肽含量>90%;小分子提取物(提取物II)中多肽含量>30%，游离氨基酸类含量>20%，糖类含量> 25%;混合提取物(提取物III)中多肽含量> 55%，游离氨基酸类含量> 12%,糖类含量> 17%。经药效学筛选证实，本实施方式制备的提取物I、II、III均具有明显的抗凝、抗血栓活性。
具体实施方式
二 本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤一中的干水蛭粉末的目数为20 40目。其它步骤及参数与具体实施方式
相同。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
一或二不同的是步骤一中室温搅拌下浸溃16h。其它步骤及参数与具体实施方式
一或二相同。
具体实施方式
四本实施方式与具体实施方式
一至三之一不同的是步骤三中的树脂柱为DlOl树脂柱、AB-8树脂、X-5树脂、HPD400树脂或活性炭。其它步骤及参数与具体 实施方式一至三之一相同。
具体实施方式
五本实施方式与具体实施方式
一至四之一不同的是步骤四中静置12h。其它步骤及参数与具体实施方式
一至四之一相同。
具体实施方式
六本实施方式与具体实施方式
一至五之一不同的是步骤四和步骤五中的低温减压浓缩是指在55 60°C的条件下进行减压浓缩。其它步骤及参数与具体实施方式
一至五之一相同。
具体实施方式
七本实施方式与具体实施方式
一至六之一不同的是步骤二中采用分子量截留为50KDa或IOOKDa超滤膜。其它步骤及参数与具体实施方式
一至六之一相同。
具体实施方式
八本实施方式与具体实施方式
一至七之一不同的是步骤三中采用分子量截留为lKDa、3KDa或5KDa超滤膜。其它步骤及参数与具体实施方式
一至七之一相同。通过以下试验验证本发明有益效果本试验的中药水蛭提取物的制备方法
一、将干水蛭研磨成粉末，取IOg干水蛭粉末，加入60L纯化水，室温搅拌浸溃16小时。在转速为IOOOOrpm的条件下进行离心，取上清液；
二、采用分子量截留为50KDa超滤膜进行超滤处理，收集滤过液，待截留液体积为5L时，用20L纯化水分4次反复稀释并继续超滤截留液。混合收集的滤过液，采用分子量截留为3KDa超滤膜进行超滤处理，待截留液体积为5L时，用40L纯化水分8次反复稀释并继续超滤截留液，分别收集截留液和滤过液。收集截留液5L，作为提取物I，冷冻保存。取滤过液，过DlOl树脂柱(生药树脂=5:1)，收集水洗液，低于60°C减压浓缩至5L，将药液冷却至4 5°C，加入4 5°C乙醇至含醇量达80%，搅拌均匀，静置12小时，滤过，收集上清液，低于60°C减压浓缩至5L，得提取物II，将提取物I和II按生药量I : I混合得提取物III。将提取物I、II、III分别进行冷冻干燥，得提取物I、II、III的干燥品，O 4°C保存。通过福林酚法测定提取物中多肽含量提取物I中多肽含量> 98%;提取物II中多肽含量彡35% ;提取物III中多肽含量彡57%。通过柱前衍生HPLC法测定提取物中游离氨基酸类含量提取物II中游离氨基酸类含量> 24% ;提取物III中游离氨基酸类含量> 14%。苯酚-硫酸法测定提取物中糖类含量提取物II中糖类含量> 25% ;提取物III糖类含量> 17%。对本试验制备的中药水蛭提取物I、II、III进行药效学试验I、体外给药对家兔血浆复钙时间(Tk)的影响采用O. 5g生药/ml的浓度试验，活性由强至弱依次为提取物III组(Tk =246. 8±12. 36s) >提取物 I 组(Τκ = 168. O±2. 62s) >提取物 II 组(Τκ = 163. 6±3. 46s)>水浸提物组(Tk= 126. 0±1. 47s)，水煎煮提取物组、水煎醇沉法提取物组和丙酮提取物组与生理盐水空白对照组比较没有明显区别。
其中提取物III、I、II与生理盐水(Tk =106. O ±3. 81s)空白对照比较有显著性差异(P < O. 01)。
2、对离体凝血酶时间(TT)的影响采用O. 5g生药/ml的浓度试验，活性由强至弱依次为提取物III组(TT104. O±4. 06s) >提取物 I 组(TT 86. 2±2. 59s) >提取物 II 组(TT 79. 6±3. 56s) >水浸提物组(TT 39. 2±2. 16s) >丙酮提取物组(TT 30. 4±1. 19s)，水煎煮提取物组和水煎醇沉法提取物组与生理盐水空白对照组比较没有明显区别。其中提取物III、I、II与生理盐水(TT 18. 4±1. 14s)空白对照比较有显著性差异(P < O. 01)。
3、全血凝块溶解活性测定采用O. 5g生药/ml的浓度试验，提取物III组在
5. 74小时全部溶解，提取物I组 在
7. 36小时全部溶解，提取物II组在
7. 52小时全部溶解，水浸提物组和丙酮提取物组在24小时内均有部分溶解，水煎煮提取物组，水煎醇沉法提取物组、丙酮提取物组与生理盐水空白对照组均未溶解。由此可知，本试验制备的提取物I、II、III均具有明显的抗凝、抗血栓活性。
权利要求
1.一种中药水蛭提取物的制备方法，其特征在于中药水蛭提取物的制备方法是按以下步骤进行的一、取干水蛭研磨成粉末，加入4 10倍重量的纯化水，室温搅拌下浸溃12 24h，在转速为IOOOOrpm的条件下进行离心，取上清液；二、采用分子量截留为50KDa IOOKDa超滤膜对步骤一中的上清液进行超滤处理，收集滤过液A ;三、采用分子量截留为IKDa 5KDa超滤膜对滤过液A进行超滤处理，分别收集截留液和滤过液B，其中截留液作为提取物I ;取滤过液B，过树脂柱，收集水洗液；四、对水洗液进行减压浓缩，然后冷却至4 5°C，再加入4 5V的乙醇至含醇量达70 80 %，然后搅拌均匀，静置10 13h，过滤，收集上清液；五、对上清液进行低温减压浓缩，得提取物II，将提取物I和II按生药量I I混合得提取物III，将上述提取物I、II、III进行冷冻干燥，即得中药水蛭提取物。
2.根据权利要求I所述的一种中药水蛭提取物的制备方法，其特征在于步骤一中的干水蛭粉末的目数为20 40目。
3.根据权利要求I所述的一种中药水蛭提取物的制备方法，其特征在于步骤一中室温搅拌下浸溃16h。
4.根据权利要求I所述的一种中药水蛭提取物的制备方法，其特征在于步骤三中的树脂柱为DlOl树脂柱、AB-8树脂、X-5树脂、HPD400树脂或活性炭。
5.根据权利要求I所述的一种中药水蛭提取物的制备方法，其特征在于步骤四中静置12h。
6.根据权利要求I所述的一种中药水蛭提取物的制备方法，其特征在于步骤四和步骤五中的低温减压浓缩是指在55 60°C的条件下进行减压浓缩。
7.根据权利要求I所述的一种中药水蛭提取物的制备方法，其特征在于步骤二中采用分子量截留为50KDa或IOOKDa超滤膜。
8.根据权利要求I所述的一种中药水蛭提取物的制备方法，其特征在于步骤三中采用分子量截留为lKDa、3KDa或5KDa超滤膜。
全文摘要
一种中药水蛭提取物的制备方法，它涉及一种水蛭提取物的制备方法。本发明是要解决现有方法制备的中药水蛭提取物中水蛭活性成分的生物活性破坏较大的问题。制备方法一、取水蛭粗粉加入纯化水，搅拌浸渍，离心后取上清液；二、对上清液进行超滤，收集滤过液A；三、对滤过液A进行超滤，收集截留液和滤过液B，截留液作为提取物I；取滤过液B过树脂柱，收集水洗液；四、对水洗液进行减压浓缩，冷却后加入乙醇调节含醇量，搅拌，静置，过滤，收集上清液；五、对上清液进行浓缩，得提取物II，将提取物I和II合得提取物III，将提取物I、II、III进行冷冻干燥，即得中药水蛭提取物。本发明的提取物均具有抗凝、抗血栓活性。本发明应用于中药领域。
文档编号A61K35/62GK102920736SQ20121050430
公开日2013年2月13日 申请日期2012年11月30日 优先权日2012年11月30日
发明者裴福成, 刘景国, 隋艳君, 解黎雯, 李文军, 郑玥, 肇静静, 李文春, 单钰毓, 王英新 申请人:哈药集团中药二厂