PCR引物如何设计

“小胡，老板让我跑一下PCR，具体我要订什么呀？”

“引物订了吗？”

“没有呀，怎么订？”

说起Real-Time PCR，大家都不陌生，毕竟是检测基因转录水平表达情况最基本的实验了。但是对于没有接触过的小伙伴来说，还是挺陌生的，所需试剂仪器就先不聊了，今天小编单就lncRNA/mRNA引物设计来说道说道。

拿到一个指标，我们首先通过NCBI的gene查询有几个转录本。只有一个转录本的话，一切好说，直接拿序列。若存在多个转录本，而要检测的是目的指标的总的转录表达水平（不考虑剪接变异体）时，一般会取该指标的所有转录本的公共序列进行设计引物（如果没有公共序列，则针对表达量最丰富的转录本进行设计）。当我们想检测一个指标的不同转录本的表达情况时，这就要单独对转录本的特有部分进行设计了。

说了这么多，那引物到底怎么设计的呀？

总的来说，我们一般主要从4方面获取，文献查询，PrimerBank，自己设计，外包公司设计。

1.     文献查询

我们把自己的指标输入pubmed，然后着重看文章的材料方法部分。如果该文章进行了real time PCR实验的话，那么在材料方法区域会单独作为实验的一个分支标注出来（如下图）。有的会提示引物序列具体见附表，有的则直接在材料方法给出，这样就可以轻松得到引物序列啦。

注：Real-time PCR一般缩写为 qPCR（quantitative real-time PCR），两者表达意思一致。

当然，文献可供选择的引物有很多，但是尽量选择高分文献，毕竟可信度较高，IF不是说说而已的。

2.     PrimerBank

如其名，这是一个储存引物的数据库  （https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/） ，目前提供人和鼠两个物种。具体操作很简单，这里输入基因官方名称后提交。

结果会显示具体针对哪个转录本设计，引物长度，扩增产物长度，具体位置等。但是缺点是不能看到参考文献，所以无从知道引物来自几分文献，所以拿到引物后尽量评价后再进行使用。具体评价引物质量的数据库，咱们之前也介绍过了，大家根据那个操作即可。

3.     自己设计

（1）     在线设计

可供在线设计的数据库相当多，这里我们以NCBI的Primer-BLAST为例，简要介绍一下使用方法。首先通过该数据库链接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/打开首页，当然我们也可以从NCBI主页面的下方导航栏进入（如下图）。

NCBI下载目的RNA的碱基序列（部分或全部序列）放入Primer-BLAST，或者输入基因，按下图所示操作进行后，点击Get Primers。

然后会跳转至以下界面。

结果主要包含两个方面

一般会设计10个引物

Graphical view of primer pairs

以图表形式显示扩增产物的长度及位置（因为上述小编没有选择跨外显子，所以下图中的引物位置没有跨外显子）

Detailed primer reports

包含引物的详细信息，如引物长度，开始结束位置，扩增产物长度，引物自身互补性等。

当我们有一对引物，想查询其扩增产物长度及特异性时，也可以使用Primer-BLAST

粘贴引物后，点击Get Primers。将会得到该引物的详细信息。根据下图，可以发现该引物没有非特性性扩增。

（2）     专业软件设计

例如Oligo，这里就暂不过多赘述了，具体使用方法，网上教程很多。

4.     公司设计

当我们通过以上几种方法得到的引物效果均不理想时，就找公司吧，具体操作：打钱就是啦。