imagej得到灰度图数据

小编又又来了！今天给小伙伴分享的是科研基础工作中常用的技术——用Image J定量分析免疫组化结果图。何为免疫组化呢？简单来说就是基于抗原-抗体特异性结合的原理，来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及相对定量的研究，通常和蛋白印迹技术相辅相成，对于研究生阶段的实验来说，几乎都会用到，所以掌握好免疫组化的分析是很有必要的呢。

双击Image J图标，打开软件，显示如下图工具框。

直接将组化图片拖动到工具框后释放，或者点击File、Open，从文件夹中选择目的图片打开，2种方式均可。(小编以人肝癌组织免疫组化染色为例进行讲解)

打开图片后，需要将组化图转换成8-bit的灰度图。点击Image、Type、选择8-bit格式，图片由彩图变为黑白图，也就是灰度图，根据图中颜色的深浅，赋予不同种灰度值，最大为255，即为纯白，最小为0，即为纯黑，0-255之间即为灰色，一共有256种灰度值(2^8=256)。合格的组化图在图中的空白区域中，灰度值理论上应为255。

免疫组化的分析结果是图片的光密度值(Optical density)即OD值，被测物质的量越多，OD值越高，透射出的光越少，反映在照片上就越黑。免疫组化DAB染色越深，OD值就越大，蛋白表达量越多。因此就需要把灰度值转化为OD值进行比较分析，图像的灰度值与对应物质的OD值成对数关系，符合朗伯-比尔定律。理论上OD值是从0到无穷大。但在实际应用中，一般定义为0-3.0。

点击Analyze，Calibrate，选择Uncalibrated OD校准。

选择需要测量的参数，点击Analyze，Set Measurements设置测量参数，勾选如图Area，Integrated density，Limit to threshold指标后，点击OK。

接下来，选择阳性区域。依次点击Image、 Adjust、 Threshold左右调节阈值，使红色区域代表组化图中DAB阳性区域。

导出数据。依次点击Analyze、Measure，导出另存为该组化图的数据，IntDen的值为该图的累积光密度值(Integratedoption density，IOD)，何为IOD呢？即图片上各点的光密度值累加得到。IOD值与目的蛋白的总量成正比。IOD值除以目的蛋白分布区域的面积，得到平均光密度值(AverageOptical Density，AOD)，通过运用AOD值作图，运用统计学分析，即可比较实验组和对照组目的蛋白表达量的差异。

公式：AOD=IOD/Area

此图的AOD值为IOD/Area=17038.064/28040=0.61。

小编给大伙们提供Image J的下载地址：https://imagej.nih.gov/ij/download.

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