荔枝酵素：至少含有24种酚类化合物
荔枝（学名：Litchi chinensis Sonn.）是无患子科、荔枝属常绿乔木，高约10米。果皮有鳞斑状突起，鲜红，紫红。成熟时至鲜红色；种子全部被肉质假种皮包裹。花期春季，果期夏季。果肉产鲜时半透明凝脂状，味香美，但不耐储藏。
营养含量：荔枝营养丰富，含葡萄糖、蔗糖、蛋白质、脂肪以及维生素A、B、C等，并含叶酸、精氨酸、色氨酸等各种营养素，对人体健康十分有益。荔枝具有健脾生津，理气止痛之功效，适用于身体虚弱，病后津液不足，胃寒疼痛，疝气疼痛等症。现代研究发现，荔枝有营养脑细胞的作用，可改善失眠、健忘、多梦等症，并能促进皮肤新陈代谢，延缓衰老。
酚类化合物是近年功能性食品领域热点研究的生物活性因子，主要包括类黄酮和酚酸两大类，具有很强的抗氧化作用，还有降血脂、凝聚血小板、抗炎症和抗癌等功能。水果酚类化合物包括鞣质、单宁及酚酸类小分子化合物，如没食子酸、鞣花酸、花青素、儿茶素及阿魏酸等。在荔枝果肉中可以检测到没食子酸、绿原酸、儿茶素、咖啡酸、表儿茶素、芦丁、槲皮素、山奈酚、反式肉桂酸、天竺葵素-3-O-葡糖苷等酚类化合物。水果中酚类化合物除了本身自有外，也可通过微生物发酵的生物转化作用生成。
近年来，对荔枝发酵饮料及酵素的研究开发也有报道。如卢嘉懿等研究了乳酸菌发酵对荔枝汁中γ-氨基丁酸含量的影响；移兰丽以粘度和浊度为指标，优化了荔枝果汁乳酸菌发酵饮料的发酵工艺；罗威等研究了利用酵母菌乳酸菌联合发酵荔枝果汁开发低醇饮品；王柳玲等以总酸含量为指标，优化了荔枝果汁红茶菌发酵工艺条件；孙淑夷以SOD、淀粉酶、蛋白酶及脂肪酶的酶活力为指标，优化了荔枝汁混菌发酵工艺。但以总酚含量为指标研究优化荔枝酵素的发酵工艺报道少见。
本研究以荔枝果汁为原料，总酚含量为指标，单因素及正交试验优化了荔枝酵素的发酵工艺；并采用HPLC分析了荔枝酵素中酚类化合物的生物转化情况，为进一步研究阐明其转化机制，进而为定向研究开发富含特定酚类化合物并且具有特定功能的荔枝酵素奠定基础。
荔枝酵素发酵工艺
荔枝酵素的发酵工艺包括荔枝榨汁、菌株培养及接种发酵等主要步骤。
（1）荔枝榨汁：取新鲜荔枝，剥皮去核取荔枝肉，无菌水冲洗2～3次，用酒精消毒榨汁机，荔枝肉上榨汁机榨汁，无菌纱布过滤去渣后得到纯荔枝果汁，-20℃保藏备用。
（2）菌株培养：分别培养酿酒酵母(YPD培养基，接种量0.1%,30℃、180r/min振荡培养)、醋酸杆菌(LB培养基，接种量0.1%，30℃、180r/min振荡培养)与植物乳酸杆菌(LB培养基，接种量0.1%,37℃、180r/min振荡培养)至对数生长中后期。
（3）接种发酵：按单因素及正交试验的接种量要求量取菌液，10000r/min，4℃下离心10min，弃上清液取菌体，无菌生理盐水洗涤菌体2次(重悬菌体后离心弃上清液)。荔枝果汁分装每瓶100mL，按单因素及正交试验要求接入相应的菌株菌体或组合菌株菌体，进行发酵。
结果与分析
总酚测定的标准曲线绘制
总酚测定的标准曲线绘制结果如图1所示。标准曲线方程为y=8.5149x-0.4992,R2=0.996 2，线性关系良好。
总酚测定的标准曲线
单因素试验
发酵菌株组合
发酵菌株组合因素试验结果如下图所示。与最小值(2醋酸杆菌)比较，1酿酒酵母、4酿酒酵母+醋酸杆菌、6醋酸杆菌+植物乳酸杆菌及7酿酒酵母+醋酸杆菌+植物乳酸杆菌差异显著(P<0.05)，说明菌株组合因素对荔枝酵素的总酚含量有显著影响。选取其中总酚含量高的1酿酒酵母、4酿酒酵母+醋酸杆菌、7酿酒酵母+醋酸杆菌+植物乳酸杆菌等三个水平，进行荔枝酵素发酵正交试验。
发酵菌株组合对荔枝酵素总酚含量的影响
发酵温度
发酵温度因素试验结果如下图所示。与最小值(38℃)比较，其他5个温度水平均有显著差异(P<0.05)，说明发酵温度因素对荔枝酵素的总酚含量有显著影响。选取其中总酚含量高的28℃、30℃、32℃三个温度水平，进行荔枝酵素发酵正交试验。
发酵温度对荔枝酵素总酚含量的影响
发酵时间
发酵时间因素试验结果如图4所示。与最小值(12h)比较，其他5个时间水平均有显著差异(P<0.05)，说明发酵时间因素对荔枝酵素的总酚含量有显著影响。选取其中总酚含量高的36h、48h、60h三个发酵时间水平，进行荔枝酵素发酵正交试验。
发酵时间对荔枝酵素总酚含量的影响
正交试验
依据单因素试验结果，选取A菌株组合(A1：酿酒酵母；A2：酿酒酵母+醋酸杆菌；A3：酿酒酵母+醋酸杆菌+植物乳酸杆菌)、B发酵温度(B1:28℃；B2:30℃；B3:32℃)及发酵时间(C1:36h；C2:48 h；C3:60h)，进行三因素三水平(L9(33))正交实验，结果如下表所示。
荔枝酵素发酵L9(33)正交试验结果
综合分析，最终确定荔枝酵素发酵工艺的最佳组合方案是A3B2C2，即发菌株组合为酿酒酵母+醋酸杆菌+植物乳酸杆菌(1∶1∶1)、发酵温度为30℃、发酵时间为48h。在此条件，3次重复验证试验结果为，荔枝酵素的总酚含量达5.894±0.106μg/mL，是荔枝果汁(总酚含量为3.818±0.142μg/mL)的1.54倍。
荔枝酵素的酚类化合物
利用正交实验确定的最优工艺进行荔枝酵素发酵，发酵后进行高效液相色谱分析。5个酚类化合物标准品的保留时间分别为(图F)：峰1绿原酸(8.278min)，峰2阿魏酸(18.441min)，峰3柚皮苷(20.900min)，峰4柚皮素(33.076min)，峰5橙皮素(34.428min)。与荔枝果汁原液(图A)比较，荔枝酵素原液(图C)酚类化合物的总含量与种类均明显增加。
HPLC分析荔枝酵素的酚类化合物
荔枝酵素中至少含有24种酚类化合物：荔枝酵素原液(图C)中检出5种(未知峰F1～F4及峰3)，其中峰3参照标准品(图F)中保留时间，可以确定为柚皮苷，其含量达0.944μg/mL；荔枝酵素5倍浓缩液(图D)中检出16种(未知峰F5～F20)；荔枝酵素20倍浓缩液(图E)中检出3种(未知峰F21～F23)。
讨论
酚类化合物具有很强的抗氧化作用，是水果中重要的生物活性功能因子之一。微生物发酵可以改变水果酵素中的总酚含量及酚的种类组成。例如，用植物乳酸杆菌发酵新鲜腰果果汁，总酚含量及单宁的种类、含量会随着发酵进程发生动态变化；百香果果汁经果酒酵母、醋酸杆菌及植物乳酸杆菌在发酵过程中的全细胞催化作用，分别新生成4种、6种及7种酚类化合物；桂圆干肉水提液经酿酒酵母、醋酸杆菌与植物乳酸杆菌混菌优化工艺发酵后，所制得的桂圆酵素中总酚含量提高了5.05倍，至少含有酚类化合物20余种，至少有16种为新生成。
本研究中，荔枝果汁经酿酒酵母、醋酸杆菌与植物乳酸杆菌混菌优化工艺发酵后，荔枝酵素的总酚含量是荔枝果汁的1.54倍；荔枝果汁检出的14种酚类化合物中13种，经发酵后均被完全转化成其他酚类物质。以上表明，微生物发酵可以改变水果酵素中的总酚含量及酚的种类组成，通过优选菌种、优化发酵工艺，进行定向研究开发富含特定酚类化合物且具有特定功能的水果酵素可行。
本研究及其他类似研究表明，水果酵素的发酵过程中存在酚类化合物的复杂转化，但水果酵素的发酵过程中酚类化合物的生物转化机制有待进一步研究阐明。在后续研究中，要引入质谱、核磁共振等分析手段，对荔枝果汁及荔枝酵素中未知的酚类化合物作准确定性，然后对照分析建立酚类化合物的生物转化模式途径并实验验证，为最终建立富含特定酚类化合物的荔枝酵素的代谢控制发酵工艺奠定理论基础。
结论
优化发酵工艺能显著增加荔枝酵素中的总酚含量，使其功能特性提升。优化得到的荔枝酵素发酵工艺为：发菌株组合为酿酒酵母+醋酸杆菌+植物乳酸杆菌(1∶1∶1)、接种量10%、发酵温度为30℃、发酵时间为48h。此工艺条件下，荔枝酵素的总酚含量达5.894±0.106μg/mL，是荔枝果汁(总酚含量为3.818±0.142μg/mL)的1.54倍。
最优工艺条件下制得的荔枝酵素中至少含有24种酚类化合物，23种为新生成，其中1种可以确定为柚皮苷，其在荔枝酵素中含量达0.944μg/mL。原荔枝果汁中酚类化合物基本被转化且伴随有新的酚类化合生成，说明荔枝酵素发酵涉及复杂的生物转化，其转化机制有待进一步研究阐明。