易基因 | 国自然选题-易基因RNA甲基化测序技术（m6A m5C）正热门
2021年国家自然科学基金结果出炉在即，首先预祝各位老师申请的本子都中标。
回顾过往十年，RNA甲基化修饰一直是国家自然科学基金表观遗传学研究的热门领域，其中m6A更是占据其中大半江山。那么究竟什么是RNA甲基化，RNA甲基化又有哪些测序技术呢？
m6A国家自然科学基因项目数量及资助金额
什么是RNA甲基化测序？
在真核生物中，5’ 端的Cap以及3’ 的ployA修饰在转录调控中起到了十分重要的作用，而mRNA的内部修饰则用于维持mRNA的稳定性。mRNA最常见的内部修饰包括N6-腺苷酸甲基化（m6A）、N1-腺苷酸甲基化（m1A）、胞嘧啶羟基化（m5C）等。RNA甲基化的作用已在众多研究中被确认，而m6A是mRNA上最丰富的内部修饰，这也成为RNA甲基化测序研究得最多最热的修饰之一。当然，m5C修饰也是非常重要的修饰。
m6A的研究方向主要为通过研究m6A修饰相关的甲基化、去甲基化酶和识别蛋白的功能，进而研究m6A修饰的生物学功能和作用机制。如通过m6A甲基化测序( MeRIP-Seq)构建疾病细胞模型或者发病组织的m6A修饰谱，分析m6A的motif，peaks数量及分布，Peak关联基因的特征，联合RNA-seq研究m6A甲基化与表达的关系等。
m5C RNA甲基化修饰由m5C甲基化转移酶介导（NSUN），在tRNA和rRNA中高丰度稳定存在。已证实m5C修饰功能涉及调控干细胞应激、细胞毒性应激、mRNA出核和植物细胞发育及基因表达等方面。
易基因RNA修饰研究优势服务技术
m6A RNA甲基化测序：微量技术，同时检测mRNA、lncRNA和circle RNA的m6A修饰
m5C RNA甲基化测序：亚硫酸盐处理，单碱基精准检测m5C修饰水平
（1）常量及微量m6A RNA甲基化测序（MeRIP/m6A-seq）
m6A甲基化修饰是真核生物mRNA甚至病毒RNA广泛存在的一种RNA修饰形式。m6A修饰早在上世纪70年代就已经被报道，但对该修饰在RNA中的整体分布以及其对基因表达调控的影响一直以来却知之甚少。2011年，第一个真正意义上的RNA去甲基化酶FTO
的报道，使得mRNA/lncRNA的甲基化研究再次进入人们的视野。MeRIP通过m6A特异性抗体富集和测序，用于研究RNA的腺苷甲基化修饰。易基因自主研发微量RNA甲基化检测技术，样本起始量可降低至10-20μg，最低仅需5μg总RNA。
常规及微量MeRIP测试结果
微量（5μg）及常规（80μg）Total RNA起始，富集m 6 A修饰片段结果展示
研究案例
Dynamic m6A mRNA methylation directs translational control of heat shock response
MeRIP-seq和RNA-seq联合分析研究热休克反应的分子机制
① 背景
热休克反应是机体在热应激情况下，表现出的以基因表达变化为特征的防御适应性反应，是生物体面对刺激时的非特异性应激反应，以保证细胞短暂适应极端环境。热休克蛋白(heat shock protein, HSP)在其中起着重要的作用。m6A是最丰富的mRNA表观修饰，调节转录本的可变剪切、RNA与蛋白质的相互作用以及RNA的稳定性。在哺乳动物细胞中，m6A并不是对称分布，在mRNA的5'UTR甲基化水平比其他功能区域低。然而，人们对5' UTR甲基化的调控基因表达机制知之甚少，且5'UTR在翻译的起始过程中起着至关重要的作用，但是对m6A在翻译中的调控作用所知甚少。
② 方法
③ 结论
研究了m6A与热休克反应的关系，绘制出了热处理影响热诱导mRNA的5' UTR甲基化水平变化的分子机制：核定位的m6A识别蛋白YTHDF 2抑制m6A去甲基化蛋白FTO与RNA的5'UTR区相互作用，从而保留热诱导RNA的5'UTR甲基化位点。研究热诱导RNA 5'UTR甲基化的动态变化与热休克反应的关系，不仅扩大了m6A调控广度，而且揭示了一个未知的热休克应的转录后调控机制，为我们研究表观修饰提供的了新角度。
（2）m5C RNA甲基化（RNA-BS-seq，m5C）
m5C是RNA百余种修饰中研究较多的一种。m5C存在于tRNA上时，可以对翻译进行调节；存在于rRNA上时，可以对核糖体的生物合成进行质控；存在于mRNA上时，则可以影响mRNA的结构、稳定性及翻译过程。
RNA-BS-seq是一种检测m5C的强有力的技术。该技术利用重亚硫酸盐处理RNA，使RNA上没有发生修饰的C则被转化为U，而发生m5C修饰的C碱基则保持为C。经过PCR，U转变成T，这样便将m5C与C区分开来。结合高通量测序，就可以从全转录组范围检测m5C修饰。
研究案例
Distinct 5-methylcytosine profiles in poly(A) RNA from mouse embryonic stem cells and brain小鼠胚胎干细胞及脑部RNA甲基化图谱研究
① 背景
最近，有不少研究报道了许多转录后的mRNA表观修饰，如m6A、m1A、假尿苷化和m5C。然而，对于m5C在整个转录组上的分布还知之甚少。因此，了解不同细胞类型、组织及个体中m5C的分布及作用，对于深入研究m5C的功能及其对其他生物过程的影响十分有必要。
② 方法
利用RNA-BS-seq技术检测了小鼠干细胞及脑部的m5C修饰图谱，并从分布、功能等方面进行比较。
③ 结论
这篇文章第一次系统地绘制了小鼠全能阶段及分化后阶段的m5C修饰图谱，并进行了比较。这对于深入了解m5C在哺乳动物中的作用及生物学意义十分有价值。
参考文献：
1. Zhou J, Wan J, Gao X, Zhang X, Jaffrey SR, Qian SB. Dynamic m(6)A mRNA methylation directs translational control of heat shock response. Nature. 2015 Oct 22;526(7574):591-4. pii: nature15377. doi: 10.1038/nature15377. PubMed PMID: 26458103.
2. Amort T, Rieder D, Wille A, Khokhlova-Cubberley D, Riml C, Trixl L, Jia XY, Micura R, Lusser A. Distinct 5-methylcytosine profiles in poly(A) RNA from mouse embryonic stem cells and brain. Genome Biol. 2017 Jan 5;18(1):1. pii: 10.1186/s13059-016-1139-1. doi: 10.1186/s13059-016-1139-1. PubMed PMID: 28077169.