MSI检测临床意义及检测方法比对
微卫星不稳定性（Microsatellite instability，MSI）作为重要标志物与多种疾病特征息息相关，其中绝大多数为肿瘤，尤其是子宫内膜癌、结直肠癌、胃癌等。随着NGS等检测技术的发展，MSI在肿瘤中的秘密被逐层揭开。求臻医学推出的“臻话MSI”系列专栏，旨在从多角度介绍MSI及其在肿瘤精准医疗领域的应用，推动肿瘤精准医疗领域的发展。
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MSI检测的临床意义 |
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MSI在肿瘤的筛查、治疗和预后的过程中具有重要的作用。
MSI-H的结直肠癌患者预后较好
MSI-H相比MSS的结直肠癌患者有更好的预后，5年生存率显著提高。同时，研究者还发现MSI-H结直肠癌转化为恶性肿瘤的机率较其他类型低，尤其对年轻的MSI-H结直肠癌患者来说，治愈机率很大。
MSI-H的Ⅱ/Ⅲ期结直肠癌不推荐5-FU单药化疗
MMR正常的结直肠癌细胞比MMR缺陷的结直肠癌细胞对5-FU更敏感，这是由于MMR蛋白组分可结合到5-FU作用的DNA上，促进细胞毒反应。许多研究表明，MSI结直肠癌患者并不能从化疗中获益。
MSI-H肿瘤患者能从PD-1/PD-L1免疫治疗中获益
MSI表型的主要特征是由于微卫星序列中未修复的DNA聚合酶滑移而导致高频率的插入/缺失。当这些插入/缺失影响编码区时，它们可能导致移码突变并产生新的抗原。当框架移位的新蛋白被降解时，这些新抗原作为副产物出现，并且衍生的多肽被呈现出来。因此，新抗原是个体的、免疫原性的多肽，对免疫系统来说是非自身的，对肿瘤是独一无二的。
图1. MSI-H产生新的抗原并引发免疫反应
CD8+T细胞可以识别肿瘤细胞表面MHC Ⅰ类分子上的这些新抗原，从而增加TIL密度，在宿主体内引发免疫应答。这种活跃的免疫微环境被dMMR/MSI-H肿瘤微环境中包括PD-1和PD-L1在内的几种免疫检查点配体的上调所平衡，这些配体允许肿瘤逃逸免疫监视。抗PD-L1和抗PD-1抗体可分别与PD-L1和PD-1结合，从而阻断免疫耐受，重新激活免疫系统抗肿瘤作用。
2017年，FDA批准帕博利珠单抗（K药）用于所有MSI-H/dMMR的晚期实体瘤的末线治疗，此后，陆续批准了纳武利尤单抗（O药）、纳武利尤单抗+伊匹木单抗（O+Y）等ICI药物的相关适应症。2021年6月，NMPA又批准帕博利珠单抗用于一线治疗MSI-H/dMMR的不可切除或转移性结直肠癌。当前，MSI已成为了泛癌种免疫治疗疗效重要的预测因素。
MSI检测是林奇综合征筛查的有效手段
林奇综合征的主要致病因素是MMR（MLH1、MSH2、MSH6和PMS2）基因以及罕见的PMS1基因的致病性胚系突变或EPCAM基因缺失导致MSH2基因沉默。因此，MMR/MSI的检测可以作为林奇综合征的初筛手段。
林奇综合征在普通人群中的发病率为1:1000，但在结直肠癌患者中的发病率高达1:100，约占结直肠癌的2.5%，因此NCCN等指南推荐所有的结直肠癌患者都应进行MSI检测以筛查林奇综合征。
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MSI检测常用方法 |
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目前，MSI相关的检测方法主要有３种：免疫组化（IHC）、聚合酶链式反应（PCR）和二代测序（NGS）。
方法１ 免疫组化（IHC）
免疫组化（IHC）是目前最常用的检测方式，通过使用相应抗体检测四种常见错配修复基因（MLH1、MSH2、MSH6和PMS2）在细胞核内表达的情况，明确是否存在错配修复缺陷。存在1种或以上蛋白表达阴性即为错配修复缺陷（dMMR）；否则为错配修复蛋白完整（pMMR）。
图2. 通过IHC检测MMR蛋白状态
方法2 PCR方法
PCR方法使用荧光标记引物和毛细管电泳确定特征位点的片段长度多态性。目前国内外常用的MSI位点有两类：Promega公司的MSI检测Panel，包括5个单核苷酸位点（BAT-25、BAT-26、NR-21、NR-24、MONO-27）及两个用于质控的五核苷酸位点（PentaC和PentaD）；以及1997年美国国家肿瘤研究所（NCI）公布的“2B3D” NCI Panel，包含2个单核苷酸位点（BAT-25和BAT-26）与3个双核苷酸位点（D2S123、D5S346和D17S250）。
后来有研究指出，二核苷酸重复较单核苷酸重复的位点敏感性更低，且存在高度的个体多态性，需要配对的肿瘤和正常样本对照才能得出结果，导致检测的灵敏度降低。因此，2002年NCI补充推荐了Pentaplex Panel，包含五个单核苷酸重复的位点：NR-21、NR-24、BAT-25、BAT-26、NR-27/MONO-27。Pentaplex Panel无需配对正常的样本，且性能更高，但是在MSH6缺陷型肿瘤中性能不高。
肿瘤样本和对照样本对比，5个微卫星位点均未出现PCR扩增片段大小改变，为微卫星稳定性（MSS）；5个MSI检测位点中1个MSI位点出现PCR扩增片段大小的改变，为微卫星低度不稳定性（MSI-L）；5个MSI检测位点中2个或者2个以上的MSI位点均出现PCR扩增片段大小的改变，为微卫星高度不稳定性（MSI-H）。MSS和MSI-L之间没有明显的肿瘤生物学特征差异，因此，临床上将MSI-L也归类为MSS。
dMMR与MSI-H具有较高的生物学一致性（90%以上）。但在临床实践过程中，免疫组化检测本身存在主观性，且受检测抗体质量、检测过程（固定、染色）等因素影响，特异性和可重复性较低，对样本质量要求高，操作也比较复杂，导致各中心的检测准确率高低不一。
IHC检测的优势是可以直接鉴定出导致MSI-H 发生的MMR缺陷基因。但是，由于结果判读标准的不统一，以及某些MMR基因错义突变导致MMR蛋白功能缺陷却保留其抗原性等因素，约10%的dMMR患者，PCR结果为MSI-H。
方法3 基于NGS的MSI检测方法
这些微卫星位点在基因组中大量存在，在大多数的捕获Panel中都会覆盖，可一次性检测高达数十至上千个微卫星位点，远多于传统PCR检测方法的5-7个位点，具有更高的准确性。同时，还可针对特点的MSI算法，设计特异性的探针，在包含了传统PCR检测的5个微卫星位点（NR-27、NR-24、NR-21、BAT-25和BAT-26）基础上，再加上基因组内发生频率显著差异的位点，将会使该panel检测更加准确。
基于NGS检测MSI的算法较多，且大多数需要配对正常样本，主要包括两大类：基于位点的repeat count分布和基于突变负荷或MS位点的indel。当前应用较为广泛的MSIsensor是一种基于位点repeat count分布的算法，其通过MS位点两端各5bp的侧翼序列来定位的，算法原理为：
对于在肿瘤和正常样本中测序深度都≥20的微卫星位点，统计其每种重复（repeat）长度的reads数目分布情况；
其次，使用卡方检验对微卫星位点上的分布进行统计检验，若存在显著差异，则认为该位点是不稳定的；
最后统计不稳定位点的比例，如果该比例超过指定的阈值，则认为该样本为MSI-H。
图3. MSIsensor基于位点的repeat count分布计算MSI状态
NGS-MSI检测也存在一定的挑战：
（1）识别有良好区分性的微卫星位点需要优良的算法和大量样本验证；
（2）重复序列捕获和测序的难度要比一般序列更高，且极易受到实验环节各种因素的影响，故在建库流程、测序参数调校和生物信息学分析等方面都更加复杂精细。
另外，值得注意的是，当前常规的MSI检测几乎都局限于组织，对于无法取到组织的部分晚期肿瘤患者，缺乏MSI结果可能让患者错失宝贵的治疗时机。近期，求臻医学生信团队与美国圣路易斯华盛顿大学（WUSTL）医学院丁莉教授团队合作开发了基于NGS数据检测血浆ctDNA中MSI状态的新算法—MSIsensor-ct。
该算法在血浆MSI（bMSI）检测上取得了新的突破，在平均测序深度为10000×，ctDNA含量在0.1%~0.4%之间的情况下，MSIsensor-ct算法正确区分了128个MSI和508个MSS实例，性能优于其他算法，解决了现有的ctDNA MSI检测方法在ctDNA含量<0.4％的样品中表现较差的问题。bMSI检测可发掘更多免疫治疗受益患者，极大地拓展了MSI检测的应用场景。
表1. MSI状态检测方法学比较
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MSI检测的适用人群 |
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总而言之，MSI是多种肿瘤或相关疾病的重要标志物，在肿瘤筛查、化疗、免疫治疗及预后评估等方面具有举足轻重的地位。相关肿瘤NCCN指南、CSCO指南、共识等推荐以下人群开展MSI检测：
所有结直肠癌患者
免疫治疗潜在获益评估的实体瘤患者
所有子宫内膜癌、胃癌、卵巢癌等Lynch
综合征相关肿瘤患者及其家族成员